人胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化中VEGF作用的分子機(jī)制研究

焦淑潔 許慧芳 張?zhí)K明 許 杰 湛延強(qiáng)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 武漢 430030 2）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

研究表明絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，各種細(xì)胞外刺激信號，均可通過這一通路影響突觸傳遞，神經(jīng)元的重塑、形態(tài)分化和生存等。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動物腦組織細(xì)胞至少有4種嚴(yán)格調(diào)節(jié)的MAPK，其中發(fā)揮主要作用的為p38α，參與多種細(xì)胞的調(diào)控增殖。本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)在體外VEGF能夠促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化［1］，給予p38 MAPK信號通路抑制劑，檢測細(xì)胞內(nèi)p38αmRNA的變化，以觀察MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否在VEGF促神經(jīng)細(xì)胞生長和分化中發(fā)揮作用，從而進(jìn)一步了解VEGF在體外hESCs神經(jīng)分化中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 人胚胎干細(xì)胞及相關(guān)培養(yǎng)基 人胚胎干細(xì)胞系TJMU1和TJMU2，由本實(shí)驗(yàn)室與同濟(jì)醫(yī)院生殖中心前期研究人員建系［2］，本實(shí)驗(yàn)室保存。誘導(dǎo)分化相關(guān)培養(yǎng)基：（1）hESCs培養(yǎng)基：KNOCKOUT DMEM（Gibco）、血清替代物（Gibco）、L－谷胺酰胺（Hyclone）、非必需氨基酸（Hyclone）、β－巰基乙醇（Sigma）、重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic－fibroblast growth factor，bFGF）（Sigma）及青鏈霉素（Hy－clone）。（2）擬胚體（Embryonic body，EB）培養(yǎng)基：hESCs培養(yǎng)基去除bFGF。（3）神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM／F12（Hyclone）、B27（Gibco）、Noggin（R＆D）、bFGF、非必需氨基酸、L－谷胺酰胺及青鏈霉素。（4）神經(jīng)元培養(yǎng)基：DMEM／F12、ITS（Sigma）、N2（Gibco）、腦源性神經(jīng)生長因子（R＆D）、表皮生長因子（R＆D）、B27、L－谷胺酰胺、非必需氨基酸及青鏈霉素。

1.2 其他實(shí)驗(yàn)試劑 VEGF（Peprotech）；p38MAPK 抑制劑SB203580：Sigma；抗Nestin抗體（神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志）；抗微管相關(guān)蛋白－2（anti－microtubule－associated protein 2，MAP－2，成熟神經(jīng)元標(biāo)志）多克隆抗體（Chemicon）；DAPI（Sigma）；FITC標(biāo)記的熒光二抗（北京中杉金橋）；Trizol and RT－PCR試劑盒（Fermentas）。

1.3 hESCs培養(yǎng)、分化及實(shí)驗(yàn)分組 hESCs復(fù)蘇后，接種于絲裂霉素滅活的胚胎鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，加入hESCs培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第6～7d機(jī)械法傳代。傳代后細(xì)胞分為3組：A組細(xì)胞序貫加入EB培養(yǎng)基、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及神經(jīng)元培養(yǎng)基常規(guī)誘導(dǎo)分化；B組細(xì)胞除常規(guī)誘導(dǎo)分化外，各階段培養(yǎng)基中分別加入10ng／mL VEGF；C組在 VEGF添加之前1h分別給予5μmol／L SB203580，B、C組VEGF作用48h，撤出后誘導(dǎo)過程同A組。

1.4 細(xì)胞免疫熒光觀察各階段細(xì)胞標(biāo)志性抗原表達(dá) 4%多聚甲醛固定爬片上生長的細(xì)胞，一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1h，DAPI復(fù)染核。中性樹膠封片，照相。各階段各組細(xì)胞隨機(jī)取3張爬片，觀察10個(gè)視野，陽性細(xì)胞率＝陽性細(xì)胞數(shù)／DAPI復(fù)染細(xì)胞數(shù)。

1.5 半定量RT－PCR檢測 （1）提取總RNA，按trizol試劑說明操作；（2）合成cDNA，采用Fermentas RT試劑盒，按產(chǎn)品說明書操作。（3）聚合酶鏈反應(yīng)，GAPDH作為參照。（4）采用Lab Works 4.0凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，Quantity One分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以（目的基因－背景）／（GAPDH－背景）的積分吸光度比值作為目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.6 MTT檢測 （1）VEGF作用48h后的神經(jīng)干細(xì)胞加MTT溶液（濃度為5mg／mL），孵育4h；（2）吸棄上清液，加DMSO振蕩；（3）選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值；（4）以不同干預(yù)為橫坐標(biāo)，各組吸光值／常規(guī)組吸光值比值為縱坐標(biāo)繪制存活細(xì)胞曲線。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光法檢測γ－分泌酶抑制劑對VEGF在hESCs神經(jīng)分化各階段的影響 hESCs到EB階段，各組細(xì)胞得到的EB數(shù)量基本相同，均為60%左右，無明顯差異；經(jīng)免疫熒光法計(jì)數(shù)，EB到神經(jīng)干細(xì)胞階段，3組細(xì)胞Nestin和MAP2陽性率的比較見表1。

表1 3組細(xì)胞Nestin和MAP2陽性率的比較 （%）

2.2 RT－PCR法檢測p38αmRNA在各組誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元中的表達(dá) p38αmRNA在VEGF作用組（B組）表達(dá)較強(qiáng)，而在p38MAPK抑制劑預(yù)處理的VEGF組（C組）中的表達(dá)與常規(guī)誘導(dǎo)組接近，見圖1、2。

圖1 3組神經(jīng)元p38αmRNA半定量分析

圖2 RT－PCR檢測3組神經(jīng)元p38αmRNA表達(dá)

2.3 MTT法結(jié)果 VEGF作用組（B組）NSCs的 MTT比值明顯高于常規(guī)誘導(dǎo)組（A組），p38MAPK抑制劑預(yù)處理的VEGF組（C組）MTT比值則與VEGF作用組（B組）相近，見圖4。

圖33 組神經(jīng)干細(xì)胞MTT比值比較

3 討論

MAPK家族成員是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)一組進(jìn)化保守的酶。近年來發(fā)現(xiàn)MAPK家族是連接細(xì)胞膜表面受體與決定性基因表達(dá)之間的重要信號調(diào)節(jié)酶，控制著細(xì)胞的適應(yīng)、增殖、分化、存活和凋亡等幾乎所有生理功能和過程，故又有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核聯(lián)系樞紐之稱。p38MAPK是MAPK家族的一個(gè)重要組成部分，早期研究認(rèn)為p38MAPK介導(dǎo)炎性因子和環(huán)境應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)，最近研究表明p38MAPK參與葡萄糖攝取、核苷酸代謝等更廣泛的細(xì)胞功能［3］。下游底物很豐富，包括多種轉(zhuǎn)錄因子和激酶等，因此引起的生物學(xué)效應(yīng)也多種多樣［4］。有學(xué)者報(bào)道［5-6］p38MAPK 通路調(diào)控某些特殊類型的神經(jīng)細(xì)胞在發(fā)育過程中的遷移，并參與了神經(jīng)元的分化、存活等生理過程，還可以通過影響神經(jīng)突觸的蛋白質(zhì)合成以及谷氨酸受體的內(nèi)吞過程而調(diào)控神經(jīng)元的生理功能。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用p38MAPK抑制劑，以了解VEGF在人胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化中的作用與MAPK信號通路有無相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在人胚胎干細(xì)胞生成EB過程中，各組細(xì)胞EB生成量無明顯差異，未觀察到VEGF對這一階段胚胎細(xì)胞發(fā)育的作用，同樣也未發(fā)現(xiàn)該階段中VEGF與p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互影響。在EB向神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中，應(yīng)用p38MAPK抑制劑（C組）后，產(chǎn)生的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量與VEGF組（B組）相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明p38 MAPK抑制劑不能拮抗VEGF的促神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用，進(jìn)而表明在人胚胎干細(xì)胞經(jīng)VEGF作用分化為神經(jīng)干細(xì)胞過程中，p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑未參與其中。而在NSCs進(jìn)一步分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中，VEGF可以促使神經(jīng)干細(xì)胞更多的向神經(jīng)元分化，p38MAPK抑制劑預(yù)處理的VEGF作用組（C組）與常規(guī)誘導(dǎo)組（A組）分化為神經(jīng)元的比例無明顯差異，未能表現(xiàn)出更多向神經(jīng)元分化的趨勢，神經(jīng)元的陽性率遠(yuǎn)低于VEGF作用組（B組）。RT－PCR半定量分析顯示，VEGF作用組（B組）神經(jīng)元的p38αmRNA含量高于p38 MAPK抑制劑預(yù)處理的VEGF作用組（C組）與常規(guī)誘導(dǎo)組（A組），這提示我們p38MAPK抑制劑抑制了VEGF的促神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元作用，說明VEGF作用的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化中，p38MAPK信號通路的激活參與其中，但是p38MAPK具體是通過抑制凋亡間接促進(jìn)神經(jīng)元生長還是直接促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)生或激活其他通路繼而發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步探討。

此外，一些研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子對胚胎皮層神經(jīng)元的神經(jīng)增殖作用由多種信號途徑介導(dǎo)，包括上調(diào)E2F轉(zhuǎn)錄因子，增加細(xì)胞周期G1／S若干關(guān)鍵組成部分的表達(dá)［7］；也有實(shí)驗(yàn)表明VEGF的促神經(jīng)生長作用可被磷脂酶C抑制劑U73122等阻斷［8］。故而VEGF發(fā)揮促神經(jīng)增長和分化效應(yīng)的信號通路是一個(gè)復(fù)雜過程，具體通路有待于進(jìn)一步闡述。

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