河北地區(qū)漢族人群RhD陰性血型中Del基因型分布

喬芳 石翠英 何路軍 王振雷 趙志弘 劉敬閃 張虹 田亞娟

到目前為止，Rh血型系統(tǒng)是國際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)已確認(rèn)的29個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最復(fù)雜、最具多態(tài)性的血型系統(tǒng)，主要包括 D、E、C、c、e 5 種抗原，D 抗原(ISBT004.001;RH1)的免疫原性最強(qiáng)，是臨床上引起新生兒溶血病、溶血性輸血反應(yīng)的最重要的血型抗原［1］，其在紅細(xì)胞上質(zhì)和量的改變可產(chǎn)生弱D、部分D和Del型，統(tǒng)稱為D變異型［2］。決定人類RH血型的RHD/CE基因位于染色體1p34.3～36.1，包括D基因和CE基因，分別由10個(gè)外顯子組成，編碼區(qū)總長(zhǎng)均為1251bp，分別編碼417個(gè)氨基酸組成的糖蛋白:D抗原和CcEe抗原。任何座位上的基因突變都可能改變抗原的蛋白結(jié)構(gòu)［3］。通常RhD抗原的確認(rèn)方法為抗人球蛋白(AHG)試驗(yàn)，但現(xiàn)已證實(shí)經(jīng)抗人球蛋白試驗(yàn)鑒定的RhD陰性個(gè)體中存在RhD弱表現(xiàn)型:RhDel型。Del表型是一種變異的極弱RhD陽性血型，會(huì)引起Rh陰性受血者產(chǎn)生抗D抗體，因此，對(duì)于包括Del在內(nèi)的極弱Rh陽性表型的研究成為熱點(diǎn)。本研究采用吸收放散試驗(yàn)檢測(cè)D抗原，鑒定出RhDel，再觀察D基因存在情況。

1 材料與方法

1.1 材料 河北地區(qū)隨機(jī)抽取2008至2010年期間河北省血液中心漢族RhD陰性獻(xiàn)血者血樣332份，無親緣關(guān)系。

1.2 血清學(xué)實(shí)驗(yàn) 按照中國輸血技術(shù)操作規(guī)程確定所有樣本的RhD、C、c、E、e抗原。3批抗-D血清來源:上海血液生物醫(yī)藥有限公司、德國BIOTEST公司、美國IMMUCOR公司。使用間接抗人球蛋白試驗(yàn)排除血樣中的弱D和不完全D表型。剩余樣本通過吸收放散實(shí)驗(yàn)篩選Del表型［4］。

1.3 Rh吸收放散實(shí)驗(yàn) IAT陰性樣本用乙醚做吸收放散試驗(yàn)，以確定是否為Del型。

1.4 基因組DNA提取 嚴(yán)格按照TIANGEN血液基因組DNA純化試劑盒說明書操作，提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280以確定DNA濃度及純度。置于－20℃保存。

1.5 RhD基因特異性外顯子的PCR檢測(cè)

1.5.1 序列特異性引物(sequence specific primers，SSP)設(shè)計(jì):根據(jù)文獻(xiàn)Maaskant-van等［5］設(shè)計(jì)的RHD基因PCR引物體系，對(duì) RHD 基因第3、4、5、6、7、9 特異性外顯子進(jìn)行等位基因特異性PCR擴(kuò)增，另合成內(nèi)對(duì)照引物HGH(human growth hormone，HGH)，引物由上海生工公司合成。見表1。

表1 RHD特異外顯子及1227A的PCR-SSP引物序列及反應(yīng)特異性

1.5.2 PCR 檢測(cè):每個(gè) PCR 反應(yīng)體系的總體積為 10 μl，含有90 ng/μl基因組 DNA，10 pmol/μl dNTPs，25mM MgCl2，內(nèi)對(duì)照引物 5 pmol/μl，RHD 基因特異性外顯子引物 10 pmol/μl，5 U/μl GoTaq Flexi DNA 聚合酶(Promega，Madison，WI，美國)。PCR 反應(yīng)流程為 95℃ 2 min，95℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照觀察結(jié)果。

1.6 RhD基因序列分析

1.6.1 PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增/測(cè)序引物序列見表2(擴(kuò)增/測(cè)序相同)。RHD基因EXON1-10共10孔，每孔50 μl dNTP-Buffer工作液中加入0.5 μl Taq 酶(5 U/μl)，再加入 5 μl樣本 DNA，1 μl擴(kuò)增引物(引物終濃度為 0.2 μmol/L)混勻。按以下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增:96℃ 2 min，1 cycle;96℃ 20 s/68℃ 60 s 5 cycles;96℃ 20 s/64℃ 50 s/72℃ 1.5 min，10 cycles;96℃20 s/61℃ 50 s/72℃ 1.5 min，25 cycles;72℃ 5 min，1 cycle。每孔再加入15～20 μl石蠟油，蓋好反應(yīng)管。將引物板放入已經(jīng)設(shè)置好參數(shù)的PCR儀內(nèi)，并啟動(dòng)PCR程序，直到循環(huán)結(jié)束。按照一定的順序，將每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)準(zhǔn)備好的1%瓊脂糖凝膠系孔中，140～150 V電泳15～20 min。觀察條帶的特異性擴(kuò)增效果。

1.6.2 測(cè)序反應(yīng):用膠提取試劑盒純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)體系:BigDye v3.1 混合液 16 μl、PCR 純化產(chǎn)物4 μl。測(cè)序反應(yīng)條件:96℃ 變性 20 s、50℃ 退火 30 s、60℃ 延伸2 min進(jìn)行25 cycles;4℃保溫。使用ABI基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Chromas2.31軟件閱讀測(cè)序圖譜進(jìn)行分析。

表2 PCR擴(kuò)增RHD10個(gè)外顯子與測(cè)序引物序列

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)分析 332例經(jīng)IAT確認(rèn)的Rh陰性樣本中各表型分布為ccee 152例，Ccee 129例，ccEe 20例，CCee 18例，CcEe 11例，ccEE 2例;檢出RhDel型72例(21.7%)。見表3。

表3 RhD吸收放散試驗(yàn)陰性個(gè)體中Rh表型和RhD基因外顯子分析 例

2.2 RhD基因特異性外顯子檢測(cè) 332例經(jīng)IAT確認(rèn)的Rh陰性樣本中，檢出RHD基因83例(25%):RHD基因外顯子完整79例，其中Ccee 62例、CCee 8例、ccEe 5例、CcEe 4例，部分缺失4例，其中Ccee 2例，CCee 2例。

圖1 PCR-SSP結(jié)果圖

2.3 RhDel基因型檢測(cè) 79例 RHDel型樣本中，檢出RHD1227A基因73例，非RHD1227A基因型6例。見圖2。

圖2 檢測(cè)RHD(K409K)等位基因的PCR-SSP結(jié)果

2.4 RhD全部外顯子測(cè)序分析 6例非RHD1227A的樣本進(jìn)行10個(gè)RHD外顯子的序列測(cè)定，均發(fā)現(xiàn)兩條RH基因都在第五外顯子的711缺失一個(gè)C，為RHD 711Del，形成移碼突變。見圖 3、4。

圖3 正常RHD基因第5外顯子和該例標(biāo)本有缺失基因的部分序列圖譜

圖4 正常RHD基因第8內(nèi)含子和該例標(biāo)本有突變基因的部分序列圖譜

3 討論

1984年，日本學(xué)者Okobo在RhD陰性獻(xiàn)血者中發(fā)現(xiàn)一種非常弱的RhD抗原表達(dá)型，命名為Del表型。其非常弱的RhD抗原無法用敏感的間接抗人球蛋白試驗(yàn)檢出，而只能通過吸收放散試驗(yàn)才可檢測(cè)出來。此型主要存在于中國和日本人群［6］，據(jù)報(bào)道臺(tái)灣地區(qū)漢族RhD陰性人群中約32.6%為Del型［6］，香港為 20% ～30%［7］，日本僅有 10%［8］。本研究中，332 例RhD陰性獻(xiàn)血者的Rh表型以ccee和Ccee頻率最高，而CCee和ccEe較低，CcEe及ccEE最低;用吸收放散試驗(yàn)確認(rèn)的332例RhD陰性樣本中進(jìn)一步檢測(cè)出83例Del型個(gè)體(25%)，與其他研究亞洲人Del型比例的報(bào)道數(shù)據(jù)相近。本組72例RhD吸收放散試驗(yàn)陰性個(gè)體中有5例為cc型，提示RhD陰性個(gè)體攜帶RHD基因與RhC抗原之間并無恒定關(guān)系。

RHD基因與編碼C、c、E、e抗原的RHCE基因具有極高的同源性(約96%)，其間僅有40個(gè)核苷酸不同，這40個(gè)核苷酸分別位于 RHD 和 RHCE基因第3、4、5、6、7、9外顯子。因此在PCR試驗(yàn)中，擴(kuò)增引物的3’末端均是RHD特異性堿基，可準(zhǔn)確檢測(cè)RHD基因的完整性［9］。RHD基因具有多態(tài)性，使Rh血型系統(tǒng)中產(chǎn)生了許多D變異的亞型。Del表型就是其中非常特殊的一種。人們發(fā)現(xiàn)Del表型個(gè)體存在幾乎完整的RhD基因，在Del型是否歸于RhD陰性這一點(diǎn)上并沒有形成共識(shí)。在日常實(shí)踐中，帶有Del表型的個(gè)體經(jīng)常遇到且不被認(rèn)定為Rh陽性。因此，Del型血液會(huì)經(jīng)常輸注給Rh陰性患者但幾乎沒有引起原發(fā)的輸血反應(yīng)。最新的幾項(xiàng)研究報(bào)道了RhD陰性患者接受了Del血型個(gè)體的血液后產(chǎn)生了免疫抗D抗體。目前在不同人種中已發(fā)現(xiàn)多種Del的等位基因［10－16］。83例Del型個(gè)體中，有79例Del型均攜帶RhD完整基因，鑒于Del表型在中國漢族人RhD陰性人群中比例較高，因而研究其分子機(jī)制、抗原表達(dá)和免疫對(duì)臨床輸血意義重大。對(duì)該79例Del型樣本進(jìn)一步進(jìn)行 PCR-SSP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有73例 Del型均攜帶 RHD(K409K)等位基因，研究結(jié)果和臺(tái)灣地區(qū)報(bào)道的一致，即主要由RHD1227A等位基因引起;另外6例非RHD(K409K)樣本，采用擴(kuò)增RHD基因第1-10外顯子及測(cè)序引物，與正常外顯子序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)6例均為兩條RH基因在外顯子5的711缺失一個(gè)C，為RHD 711Del，710-712的CCG變成為CGT，形成移碼突變所致，并同時(shí)檢測(cè)到在內(nèi)含子8的4779的位置處存在一個(gè)純合突變，即4779C/T，而外顯子9未發(fā)現(xiàn)異常，該結(jié)果在河北地區(qū)屬首次報(bào)道。另外該種Del表型的分子背景中，是否第5外顯子的缺失與第8內(nèi)含子的純合突變同時(shí)存在，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本。

目前，世界上至少發(fā)現(xiàn)了2例真正的Rh陰性受血者由于輸入Del表型血液，而產(chǎn)生抗D的病例［17］。在血清學(xué)試驗(yàn)中，鑒定Del型的吸收放散試驗(yàn)較繁瑣，而且受多種因素制約，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)難以判斷，本研究中通過比較血清學(xué)的吸收放散試驗(yàn)和RhD基因特異性外顯子檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果證明血清學(xué)試驗(yàn)有11例Del漏檢。所以應(yīng)進(jìn)一步研究Del型分子機(jī)理，建立簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的基因定型方法，作為確認(rèn)Del型的理想替代方法。本研究結(jié)果表明利用堿基多態(tài)性設(shè)計(jì)序列特異性引物，建立簡(jiǎn)易的PCR-SSP方法是一種檢測(cè)Del表型的可行途徑。

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