肝外膽管癌CD44v6、MMP-2的表達(dá)及意義

朱林生 王勇 常桂芝

CD44(Cluster of differentiation，CD)是一種分布極為廣泛的表面跨膜糖蛋白，是一種表面粘附分子，主要參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的特異性黏附過(guò)程。廣泛存在于白細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上，屬于黏附分子中選擇素家族的一員。人類CD44基因位于11號(hào)染色體短臂上，CD44分子具有廣泛的生物學(xué)功能，包括介導(dǎo)多種細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，介導(dǎo)白細(xì)胞與活化的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合參與炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢，并參與細(xì)胞偽足的形成和遷移運(yùn)動(dòng)。其中CD44v6因有組織的特異性，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和預(yù)后中起重要作用，因此近年來(lái)備受關(guān)注?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMPs)是一組鋅離子依賴性內(nèi)源性蛋白酶，根據(jù)其底物的不同，可分成膠原酶、明膠酶、溶基質(zhì)素等。其中MMP-2屬于明膠酶A類，分子量為72 kD，主要水解Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠及TNF-α。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是廣泛存在于細(xì)胞之間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由膠原構(gòu)成，其除對(duì)細(xì)胞起支持與連接作用外，還參與細(xì)胞的增殖及分化等多種生理過(guò)程。MMPs是一組ECM的重要降解酶，對(duì)ECM的穩(wěn)定有重要作用。近年來(lái)大量證據(jù)表明基質(zhì)金屬蛋白酶，特別是MMP-2在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解中起重要作用。MMP-2活性和表達(dá)的增加與人類多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)膽管癌組織、膽管良性病變組織中CD44v6及MMP-2的表達(dá)情況，揭示CD44v6及MMP-2與膽管癌分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，為腫瘤臨床診斷、治療及預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所有肝外膽管癌標(biāo)本均選自我院2008年12月至2010年5月手術(shù)切除原發(fā)性膽管癌患者45例，其中男26例，女19例，男女比例為1.39∶1;年齡47～75歲，平均年齡53.7歲;術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。術(shù)后病理組織學(xué)均為腺癌。分化程度:高分化17例，中分化15例，低分化13例。TNM分期:Ⅰ，Ⅱ期共12例，Ⅲ期20例，Ⅳ期13例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。正常對(duì)照非癌膽管組織10例，因梗阻性黃疸、膽管炎、膽總管囊腫行膽腸吻合術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為非癌膽管組織，膽總管囊腫6例，硬化性胰腺炎2例，胰膽管合流異常1例，十二指腸乳頭炎致膽總管狹窄1例。所有標(biāo)本均為手術(shù)切除新鮮標(biāo)本。標(biāo)本取材后由中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。每份標(biāo)本連續(xù)4 μm厚切片3張，1張行常規(guī)HE染色核實(shí)診斷，2張用于免疫組織化學(xué)染色。試劑:鼠抗人CD44v6單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Zemd公司，濃縮液0.1 ml。鼠抗人MMP-2單克隆抗體，濃縮液0.1 ml。SP試劑盒、DAB顯色劑均由北京中山生物制品公司提供。

1.2 方法 CD44v6及MMP-2均用鼠抗人單克隆抗體連續(xù)4 μm厚超薄組織切片行免疫組織化學(xué)染色，染色過(guò)程中每批均設(shè)立以PBS代替相應(yīng)一抗制成的陰性對(duì)照片，以除外假陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定 CD44v6及MMMP-2均為細(xì)胞漿、細(xì)胞膜表達(dá)。(1)依據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分:0分:細(xì)胞無(wú)顯色;1分:淺黃色;2分:棕黃色;3分:棕褐色。(2)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分:0分:無(wú)顯色癌細(xì)胞;1分:顯色癌細(xì)胞占切片癌細(xì)胞總數(shù)1/3以下;2分:顯色癌細(xì)胞占切片癌細(xì)胞總數(shù)的1/3～2/3;3分:顯色癌細(xì)胞占切片癌細(xì)胞總數(shù)的2/3以上。400倍顯微鏡下每張切片記數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞。每例腫瘤積分等于以上兩項(xiàng)之和。分為:－:0分;+(低表達(dá)):1～4分;++(高表達(dá)):＞4分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用直接概率、χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD44v6、MMP-2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 CD44v6、MMP-2表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與膽管癌分化程度無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 CD44v6、MMP-2的表達(dá)與臨床病程特征關(guān)系 例

2.2 CD44v6、MMP-2在膽管癌、非癌膽管組織中的表達(dá)CD44v6、MMP-2在膽管癌、非癌膽管組織的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2，圖1、2。

表2 CD44v6、MMP-2在膽管癌與非膽管癌組織中的表達(dá) 例

圖1 膽管癌組織中CD44v6陽(yáng)性表達(dá)(10×40，++)

圖2 膽管癌組織中MMP-2陽(yáng)性表達(dá)(10×20，++)

3 討論

CD44是1989年前后發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白。多項(xiàng)研究顯示CD44v6的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良愈后明顯相關(guān)［1－4］。CD44v6參與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制為:(1)CD44v6與透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合，并通過(guò)HA發(fā)揮促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。HA可介導(dǎo)原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶中生長(zhǎng);膜表面表達(dá)有CD44v6的腫瘤細(xì)胞與HA結(jié)合后，HA可幫助其完成免疫逃逸，延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞在血循環(huán)中的時(shí)間;當(dāng)腫瘤細(xì)胞表面的CD44分子與血管周圍的HA結(jié)合，則腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)受體介導(dǎo)的吞噬作用將HA在溶酶體中降解，使之更易進(jìn)入循環(huán)而產(chǎn)生轉(zhuǎn)移，這與吳迪等［3］的肝癌移植術(shù)中腫瘤播散組與無(wú)腫瘤播散組血清CD44v6水平差異有顯著性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到了相互印證。CD44與HA作用減弱使腫瘤細(xì)胞更易于脫離原發(fā)灶，進(jìn)入淋巴或血液循環(huán)，CD44與HA相互作用的增強(qiáng)，使腫瘤細(xì)胞易于附著于異地形成轉(zhuǎn)移灶。(2)使腫瘤細(xì)胞獲得與活化的淋巴細(xì)胞相類似的生物學(xué)特點(diǎn)?；罨腡、B淋巴細(xì)胞均表達(dá)CD44v6，活化的淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有許多相類似的生物學(xué)特點(diǎn)，如黏附、遷移、外滲及浸潤(rùn)等。這些相似性可能基于完全相同或相似的分子特性。CD44v6可使腫瘤細(xì)胞獲得與活化的淋巴細(xì)胞相類似的生物學(xué)特性，模仿淋巴細(xì)胞歸巢過(guò)程，參與腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(3)影響細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的構(gòu)象和分布，改變腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。李祖國(guó)等［5］觀察了CD44v6對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞骨架的影響，發(fā)現(xiàn)CD44v6單克隆抗體封閉前后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的構(gòu)象和分布明顯不同，認(rèn)為CD44v6可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)羥基端結(jié)構(gòu)影響細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的構(gòu)象和分布，從而改變腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力參與腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制。(4)研究結(jié)果顯示CD44v6分子參與了新生血管的形成，從而惡性腫瘤的微血管密度(MVD)表達(dá)上調(diào)［6］。(5)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，CD44v6可催化Met及其配體復(fù)合物的形成，抗CD44v6抗體可阻斷Met的活化［7］。已知受體酪氨酸激酶的胞漿結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中各種成分的停泊點(diǎn)。缺乏激酶結(jié)構(gòu)域的受體常需與受體酪氨酸激酶協(xié)同作用，或通過(guò)調(diào)控激酶的活性而介導(dǎo)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD44黏附分子則具有這種協(xié)同受體作用CD44參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中跨膜復(fù)合體的組裝［8］，在細(xì)胞增殖與停滯間充當(dāng)分子開關(guān)的角色，當(dāng)CD44胞漿結(jié)構(gòu)域尾部與磷酸化的ERM蛋白結(jié)合時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，而與脫磷酸化的Merlin蛋白結(jié)合時(shí)則阻斷Ras→Raf→MEK→ERK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。

MMPs是一組鋅離子依賴的內(nèi)源性蛋白酶，根據(jù)其底物的不同可分為膠原酶、明膠酶及溶基質(zhì)酶素等。MMP-2屬于明膠酶A。MMPs的抑制劑稱為組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。MMP-2的表達(dá)上調(diào)及MMP-2/TIMMP-2比例失衡被認(rèn)為與惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)［9－11］。MMP-2的主要水解底物為Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠及TNFα。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)主要由Ⅳ型膠原及層粘連蛋白(LN)等構(gòu)成。MMP-2可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，在正常穩(wěn)定狀態(tài)組織中MMP表達(dá)量極少，而在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中表達(dá)量上升。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP-2在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程中起主要作用，轉(zhuǎn)染S100A4基因上調(diào)MMP-2表達(dá)使胰腺癌細(xì)胞具有高侵襲性，MMP-2表達(dá)下調(diào)胰腺癌細(xì)胞體外遷移和侵襲能力顯著降低［10，12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著MMP-2表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞也增多［13］。MMP-2在腫瘤新生血管形成中也起重要作用。MMP-2可誘導(dǎo)血管新生亦被基因敲除的動(dòng)物模型所證實(shí)［14］。

因此我們可聯(lián)合檢測(cè)術(shù)后膽管癌組織中CD44v6及MMP-2的表達(dá)作為預(yù)后指標(biāo)，同時(shí)我們應(yīng)以CD44v6及MMP-2為切入點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，開辟膽管癌治療新領(lǐng)域。

1 安鑫，趙浩亮，李剛.膽管癌與CD44v6和MMP-9表達(dá)相關(guān)性的研究.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，9:27-28.

2 李明今，崔銀姬，李柱虎，等.胃癌中CD44s和CD44v6的表達(dá)及意義.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25:417-418.

3 吳迪，鄭虹，朱志軍，等.肝癌肝移植術(shù)中腫瘤播散以及與CD44V6及MMP-9相關(guān)性的研究.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18:1521-1524.

4 何雪云，何曉燕.胃癌中CD44V6和PTEN表達(dá)及意義.腫瘤學(xué)雜志，2010，16:767-769.

5 李祖國(guó)，丁彥青，鄧永建，等.CD44v6在不同轉(zhuǎn)移能力人大腸癌細(xì)胞中的表達(dá).臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1998，6:216-218.

6 Gratzinger D，Canosa S，Engelhardt B，et al.Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，modulates endothelial cell motility through small G-protein.Rho FASEB J，2003，17:1458-1469.

7 Orian RV，Chen L，Sleeman JP，et al.CD44 is required for two consecutive steps in HGF/c-Met signaling.Genes Dev，2002，16:3074-3086.

8 Ponta H，Sherman L，Herrlich PA.CD44:from adhesion molecules to signaling regulators.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4:33-45.

9 朱振龍，張鈺，楊艷紅，等.大腸腺癌組織中MMP-2和TIMP-2的表達(dá)及臨床意義.腫瘤防治研究，2008，35:212-214.

10 Quaranta M，Daniele A，Coviello M，et al.MMP-2，MMP-9，VEGF and CA15.3 in breast cancer.Anticancer Res，2007，27:3593-3600.

11 郭榮平，鐘崇，石明，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶2在肝細(xì)胞癌的表達(dá)及臨床意義.中華腫瘤雜志，2006，28:285-288.

12 李娜，宋茂民，陳肖華，等.S100A4-siRNA體外轉(zhuǎn)染下調(diào)MMP-2表達(dá)抑制胰腺瘤細(xì)胞侵襲能力的研究.北京醫(yī)學(xué)，2010，32:562-564.

13 秦堅(jiān)，單宏超.結(jié)直腸癌MMP-2的表達(dá)與血液微轉(zhuǎn)移的關(guān)系.中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2008，9，4-7.

14 Itohi T，Tanioka M，Yoshida H，et al.Reduced angiogenesis and tumor progression in gelatinase A-deficient mice.Cancer Res，1998，58:1048-1051.