大鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡機(jī)制的研究1)

王 曄,劉乃紅,王 銳,楊小榮,李建國,張 策

目前對缺血后腦損傷的機(jī)制尚未闡明,臨床上也無理想的治療手段[1,2]。海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元對于缺血性損傷特別敏感。在缺血再灌注過程發(fā)生過程中,如果缺血過程較為短暫,則細(xì)胞死亡主要表現(xiàn)為遲發(fā)性的神經(jīng)元死亡,即凋亡[3,4]。NM DA受體過度激活或不受調(diào)控的活化已經(jīng)被證實(shí)牽涉在諸如腦中風(fēng)、腦創(chuàng)傷等許多急慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥中,并介導(dǎo)了興奮毒性神經(jīng)元死亡[5-11]。NMDA受體特異性拮抗劑的使用,發(fā)揮了不同程度的缺血再灌注后保護(hù)作用蛋白激酶C,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的家族成員,在記憶的形成、誘導(dǎo)LTP和突觸囊泡的釋放中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作[12]。用[13]。NMDA受體是 PKC的潛在作用靶點(diǎn),PKC可以使NR1、NR2B、NR2B等 NMDA受體亞基發(fā)生磷酸化而活化[14,15]。鈣調(diào)節(jié)蛋白酶Ⅱ(Calmodulin,CaMⅡ在神經(jīng)元損傷繼而發(fā)生的鈣離子大量內(nèi)流中發(fā)揮著重要作用,其與NM DA受體亞基NR2B亞基形成的復(fù)合物在神經(jīng)元損傷中發(fā)揮著重要的作用。本研究旨在研究大鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)NM DA受體NR1、NR2A、NR2B亞基的磷酸化水平變化及其與神經(jīng)元死亡之間的關(guān)系,探索這種表達(dá)變化可能的上游調(diào)控因子。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 雄性Wistar大鼠50只(體重180 g～250 g),由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用改良Pulsinelli四血管夾閉方法進(jìn)行短暫前腦缺血。大鼠存活6 h、24 h或48 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 Caspase-3活性檢測 用酶標(biāo)法測定腦組織裂解物中Caspase-3的活性,蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化校正后的OD值:以正常組的活性為1,計(jì)算其余各組的相對活性。

1.3 Western-Blot檢測 大鼠在短暫性全腦缺血15 min后再灌注,在缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)(6 h、24 h、48 h)斷頭取腦,分離出海馬,并迅速在解剖顯微鏡下將海馬CA1區(qū)組織分離出來。提取腦組織細(xì)胞膜蛋白樣品。聚丙烯酰胺凝膠變性電泳(SDS-PAGE)及蛋白印跡完畢后,抗體按照1∶1 000稀釋,β-actin作為內(nèi)參。經(jīng)KODAK IS440自顯影系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影,使用KODAK MI軟件進(jìn)行吸光度值測定分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,成組設(shè)計(jì)的多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3活性檢測 與對照組相比,缺血再灌注組Caspase-3酶活性顯著升高,隨著再灌注時(shí)間的延長而逐漸增加,并且在缺血再灌注24h時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)caspase-3酶活性變化

2.2 缺血再灌注后各蛋白磷酸化水平 N R1亞基作為NMDA受體的基本亞基,其磷酸化水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,并且在24 h達(dá)到高峰,但在48 h時(shí)有明顯下降,與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見圖2)。NR2B亞基磷酸化水平與NR1亞基的磷酸化水平變化趨勢相似,在24 h達(dá)到高峰,48 h開始下降,與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見圖3);但是,NR2A亞基磷酸化水平隨著缺血再灌注時(shí)間的延長呈現(xiàn)持續(xù)增高的趨勢,與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見圖4)。

蛋白激酶C的磷酸化水平在腦缺血再灌注后呈現(xiàn)逐漸增高趨勢,6 h即有明顯增高,于24 h達(dá)到高峰,在48 h略有下降,與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見圖5)。

鈣結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白酶Ⅱ(CaMⅡ)磷酸化水平在腦缺血發(fā)生過程中呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢,與 NR1、NR2B、PKC磷酸化水平變化趨勢相似,于24 h達(dá)到高峰,48 h略有下降,與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見圖6)。

3 討 論

本研究表明,大鼠全腦缺血再灌注發(fā)生過程中,Caspase-3的活性隨著缺血再灌注時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸升高趨勢,于24 h達(dá)到高峰,并且于48 h開始下降,這與 NMDA受體、PKC和CaMII的變化具有相同變化趨勢。提示其參與了腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷。Western-Blot結(jié)果提示海馬CA1區(qū)組織中NMDA受體亞基NR1,NR2A,NR2B的磷酸化水平變化呈現(xiàn)時(shí)間依賴性改變,并且在海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元未發(fā)生大量凋亡前就有了明顯的增高。其中,NR1和NR2A于24 h達(dá)到高峰,48 h開始下降;NR2A亞基的磷酸化水平水呈現(xiàn)持續(xù)性升高的趨勢,這可能與其他激酶,如SFKS(Src family tyrosine kinases)介導(dǎo)的NM DA受體磷酸化有關(guān)。機(jī)體中最大的酪氨酸激酶系統(tǒng)之一Eph-ephrin配體受體系統(tǒng)通過其中的配體EphrinB2反向信號(hào)介導(dǎo)了由SFKS參與的NMDA受體亞基NR2A磷酸化[16,17]。本研究中,NMDA受體中的不同亞基如NR1、NR2A和NR2B的磷酸化水平變化趨勢不完全相同,因此推測在腦缺血再灌注發(fā)生后,含有NR2A或者NR2B亞基的NMDA受體通過不同功能變化,共同影響了神經(jīng)元死亡。

PKC,作為G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中第二信使傳遞中的重要一環(huán),在腦學(xué)習(xí)記憶中也具有關(guān)鍵性的作用[13],其參與了LTP的誘導(dǎo)形成以及突觸囊泡的釋放。PKC的激活在非洲爪蟾卵細(xì)胞上增加了NMDA受體通道的開放,以及促使NM DA受體在細(xì)胞膜上表達(dá)增多[18]。PKC在絲氨酸890、896位點(diǎn)磷酸化NMDA受體亞基NR1,并且促使了NMDA受體向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)[19,20]。在本實(shí)驗(yàn)中,PKC的磷酸化水平與NMDA受體NR1、NR2B亞基的磷酸化水平具有時(shí)間上的相關(guān)性。表明在腦缺血再灌注發(fā)生過程中,NM DA受體亞基的磷酸化與PKC有關(guān)。CaMⅡ的激活依賴于NMDA受體的激活、胞外鈣離子大量內(nèi)流以及其自身的磷酸化[21]。本研究發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注發(fā)生過程中,CaMⅡ呈現(xiàn)出與PKC、NR2B磷酸化水平變化相同的趨勢,PKC、NR2B、CaMⅡ三者參與了海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性死亡過程。2000年Strack等[22]研究發(fā)現(xiàn),插入在胞漿內(nèi)部的NR2B第1290-1309位氨基酸殘基是CaMⅡ的結(jié)合部位,而且由于CaMⅡ具有自身磷酸化的作用,導(dǎo)致了CaMⅡ與NR2B亞基具有非常高的結(jié)合能力[23]。這與本研究結(jié)果相一致。

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