清開靈對缺氧體外血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1表達的影響1)

朱海燕,馬 濤,婁利霞,婁晉寧,劉明嶺,徐 冰,高永紅

缺血性中風一直是臨床上的治療難題,血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的破壞既是腦缺血損傷的結(jié)果,又是進一步導致腦損傷的關鍵環(huán)節(jié)[1],而BBB通透性的改變與緊密連接(tight junction,TJ)的主要成分ZO-1分布及缺失密切相關[2]。清開靈對缺血性中風急性期患者有良好的治療作用[3,4]。探討腦缺血后BBB上主要功能蛋白ZO-1的改變及清開靈對其表達的影響,對腦中風初期的治療及預后具有重要意義,同時還有助于揭示清開靈抗腦缺血性損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 Balb/c小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系細胞(中日友好醫(yī)院婁晉寧教授惠贈),經(jīng)抗Ⅷ因子抗體、抗CD31抗體及DiI-乙酰化低密度脂蛋白標記攝取檢測,符合內(nèi)皮細胞特性[5]。

1.2 主要藥品及試劑 清開靈注射液(每支 10 mL,批號:810906A,北京中醫(yī)藥大學);內(nèi)皮細胞生長因子(由中日友好醫(yī)院臨床研究所病理生理室提取);SV總RNA純化系統(tǒng)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(promega公司);Power Sybr Green PCR Master Mix(ABI公司);PVDF膜(millipore公司);RIPA裂解液(普利萊基因公司);ECL發(fā)光液(碧云天公司);蛋白質(zhì)Marker(Fermentas公司);Cocktail蛋白酶抑制劑、PhosSTOP磷酸酶抑制劑(Roche公司);BCA蛋白定量測定試劑盒(塞馳公司)。

1.3 主要儀器 M x3000p定量PCR儀(ZA29-M x3000P,Stratagene公司);倒置相差顯微鏡(Olympus IM T-2);高速冷凍離心機(HC-3018R,科大創(chuàng)新)。低氧 CO2培養(yǎng)箱(MiniGalaxy A,RS biotech公司);CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC,SANYO公司),可見光紫外分光光度計(Multispec1501,島津公司);Genegenome凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司);BioRad Mini-4垂直電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀(Biorad公司);Genegenome凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)。

1.4 腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 液氮中取出細胞凍存管,37℃水浴箱迅速融化,傳至已用明膠包被的培養(yǎng)瓶中,放入適量內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),1 d～2 d換液,3 d～4 d傳代一次,用胰酶消化細胞;實驗采用第24代細胞。

1.5 實驗分組 將單細胞懸液接種于60mm培養(yǎng)皿中,每皿5×105mL個細胞,加培養(yǎng)基 4 mL,置CO2培養(yǎng)箱中孵育,待細胞90%以上融合時隨機分為5組。正常對照組,細胞培養(yǎng)液換成有糖Earle液,在CO2培養(yǎng)箱中正常24 h培養(yǎng)。模型組,采用缺氧缺糖模擬缺血。細胞培養(yǎng)液換成無糖 Earle液,在培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2,1%O2的低氧CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。清開靈低、中、高劑量組,缺氧缺糖同時分別加入0.25%、0.50%、1.00%清開靈培養(yǎng)24 h。尼莫地平組,缺氧缺糖同時加入100 μ g/mL尼莫地平培養(yǎng)24 h。每組設6個復孔。

1.6 熒光實時定量PCR反應

1.6.1 總RNA提取 采用SV總RNA純化系統(tǒng)試劑盒提取總RNA,在紫外分光光度計中測OD260、OD280值,計算 RNA濃度和含量。采用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒進行mRNA反轉(zhuǎn)錄反應。1.6.2 引物合成 通過檢索NCBI獲得小鼠ZO-1 mRNA基因序列,引物交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設計并合成。ZO-1:Forward5'-AGGACACCAAAGCATGTGAG-3',Reverse 5'-GGCATTCCTGCTGGTTACA-3',擴增片段長度86 bp;內(nèi)參 β-actin:5'-AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG-3',Reverse 5'-TGG CGT GAG GGA GAG CAT AG-3',擴增片段長度185bp。

1.6.3 熒光實時定量PCR反應 反應體系及反應條件:總反應體系25 μ L,2 mix 12.5 UL,無 RNA 酶水 5.5 U L,cDNA 5 UL,上游引物 1 UL(10 μ mol/L),下游引物 1 UL(10 μ mol/L),反應條件:95℃10 min預變性;然后95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,40次循環(huán)。反應結(jié)束計算機自動計算CT值。擴增效率標準曲線、熔解曲線和擴增曲線:每個引物均把CDNA按倍比稀釋5次。觀察熔解曲線和擴增曲線。

2 結(jié) 果

2.1 標準曲線、熔解曲線和擴增曲線 求得標準曲線,基因擴增效率(Eff)=95.2%,相關系數(shù)(Rsq)=0.999,可見引物的Eff在(100±10)%,Rsq＞0.98,呈良好的線性關系,定量結(jié)果準確可靠。各組目的基因PCR產(chǎn)物的擴增曲線平滑,有明顯的指數(shù)擴增期;熔解曲線為單特異峰,Tm值均＞80℃,說明沒有引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物。

2.2 熒光實時定量ZO-1基因轉(zhuǎn)錄量 CT值表示每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),根據(jù)2-△△CT法求出初始cDNA的相對量。模型組ZO-1基因轉(zhuǎn)錄量顯著低于正常對照組(P＜0.01);清開靈中、高劑量組和尼莫地平組能明顯升高缺氧復氧后微血管內(nèi)皮細胞ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄,(較模型組)(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組ZO-1基因轉(zhuǎn)錄量(±s)

組別 n ZO-1正常組 6 1.017±0.11991)模型組 6 0.313±0.0542)清開靈低劑量組 6 0.433±0.1382)清開靈中劑量組 6 0.702±0.1271)清開靈高劑量組 6 0.983±0.3601)尼莫地平組 6 0.834±0.1331)與模型組比較,1)P＜0.01;與正常組比較,2)P＜0.01

2.3 ZO-1蛋白表達量 與正常對照相比,模型組ZO-1表達量降低78.90%,表明缺氧損傷能顯著抑制細胞ZO-1蛋白的表達(P＜0.05)。與模型組相比,低、中、高劑量清開靈分別使ZO-1的表達量提高3.635倍(或 363.51%)、5.554倍(或 555.40%)和7.919倍(或791.89%),清開靈可顯著提高缺氧損傷后細胞ZO-1蛋白的表達(P＜0.05)。清開靈高劑量組增加ZO-1蛋白的表達非常顯著,甚至超過正常組該蛋白的表達水平(P＜0.01)。詳見表2。

表2 ZO-1蛋白表達量(±s)

表2 ZO-1蛋白表達量(±s)

組別 n ZO-1正常組 6 0.35±0.1311)模型組 6 0.074±0.0133)清開靈低劑量組 6 0.343±0.0981)清開靈中劑量組 6 0.485±0.1482)清開靈高劑量組 6 0.660±0.1392)尼莫地平組 6 0.582±0.1322)與模型組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與正常組比較,3)P＜0.05

3 討 論

缺血性腦中風會首先損傷大腦的BBB,使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,造成BBB的屏障功能下降,通透性增加[6]。Preston[7]等通過計算BBB對大分子示蹤劑和水分子示蹤劑通透性的轉(zhuǎn)運常數(shù)發(fā)現(xiàn),大鼠短暫性腦缺血再灌注后BBB通透性的增加主要是由TJ開放導致,而并非是胞飲轉(zhuǎn)運增強,腦微血管內(nèi)皮細胞的TJ閉鎖小帶長度隨著再灌注時間延長逐漸減少。

腦微血管內(nèi)皮細胞間的TJ是BBB最主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎,它能夠封閉內(nèi)皮細胞頂部的細胞間隙,阻止細胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細胞間隙進入組織內(nèi),是BBB發(fā)揮屏障功能的主要結(jié)構(gòu)[8]。在TJ的構(gòu)成及功能等方面發(fā)揮重要作用的胞質(zhì)附著蛋白家族,尤其是ZO-1的缺失、分裂,與屏障滲透性的增加有著密切的關系[9]。ZO-1是第一個被證實的TJ胞質(zhì)蛋白,是膜結(jié)合鳥苷酸激酶同系物家族中唯一可形成高度穩(wěn)定二聚體的蛋白[10]。正常情況下,ZO-1在細胞膜表面表達,并且在胞質(zhì)內(nèi)有多個結(jié)合位點,能與跨膜蛋白和TJ蛋白的C端相互作用,將跨膜蛋白和細胞骨架連接在一起。同時,ZO-1還與另一個胞質(zhì)附著蛋白2扣帶蛋白的尾端相連,為附著蛋白和跨膜蛋白的連接提供支架。因此,ZO-1對維持TJ的連續(xù)性和完整性發(fā)揮重要作用。

BBB的破壞既是腦缺血損傷的結(jié)果,又是進一步導致腦損傷的關鍵環(huán)節(jié)。在缺血早期,微血管內(nèi)皮細胞上炎癥因子的表達使缺血性損傷向炎性損傷轉(zhuǎn)變,白細胞與微血管內(nèi)皮細胞黏附后從血管內(nèi)向腦實質(zhì)轉(zhuǎn)移,改變TJ的結(jié)構(gòu),導致ZO-1的崩解,進而誘發(fā)血管源性水腫和出血[11,12]。

清開靈可以抑制缺血損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞炎癥調(diào)節(jié)因子NF-κ B的表達,下調(diào)黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達水平,減少白細胞的黏附[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn),缺血24 h后腦微血管內(nèi)皮細胞中ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達均明顯減少,而清開靈可明顯增加ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,并表現(xiàn)出劑量依賴的趨勢。但是清開靈對ZO-1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的影響并不平行,對ZO-1轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)表現(xiàn)出更強的干預作用,使蛋白表達顯著升高,清開靈高劑量組ZO-1的表達量甚至超過了正常狀態(tài)下BBB的表達,這說明損傷狀態(tài)下的BBB對清開靈的反應非常敏感。清開靈能通過其他途徑放大其對ZO-1蛋白表達的影響。

“毒損腦絡”是清開靈治療缺血性腦中風的理論基礎。該理論認為中風發(fā)病是由于毒邪損傷腦絡,絡脈破損或絡脈拘攣瘀閉,氣血滲灌失常所致[15]。腦微血管在分布和功能等方面與中醫(yī)絡脈相似[16],清開靈不但能夠抑制缺血后白細胞活化對微血管內(nèi)皮的毒性損傷,還能恢復腦微血管BBB的分子結(jié)構(gòu)和功能,進而保證氣血的正常運行。有關清開靈對TJ的作用機制還需進一步的研究證實。

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