關白附總堿鹽抗大鼠房顫作用

湯依群 尹月淼 黃 潞 汪旻暉 于雪莉 徐 靜

（中國藥科大學臨床藥學教研室，江蘇 南京 210009）

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是臨床上最為常見的快速性心律失常，可引起血流動力學發(fā)生改變和腦栓塞等嚴重并發(fā)癥，AF已成為心律失常領域的研究熱點。

關白附為中藥毛莨科黃花烏頭Aconitum coreanum（Levl,） Rapaics的塊根，主治心痛血痹，具有祛風，燥濕，化痰，止痛作用[1,2]，化學成分主要有關附庚素 （Guanfu base G，GFG），關附甲素 （Guanfu base A，GFA），關附壬素 （Guanfu base I，GFI） 等，其中關附甲素為首次發(fā)現(xiàn)的全新結(jié)構(gòu)類型的安全、有效的廣譜抗心律失常一類新藥，已獲得國家新藥證書和生產(chǎn)批文。我們以關白附總生物堿提取物為有效部位，控制總生物堿含量達50%以上，在國家新藥創(chuàng)制重大專項基金支持下，進行抗房顫口服制劑的開發(fā)。

本實驗選用尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液制備大鼠心房顫動模型[3]，結(jié)合western-blot實驗，觀察關白附總堿鹽抗房顫作用。

1 材料與方法

受試藥：關白附總堿鹽，編號2010-0505，（GFI 2.7%，GFA 82.9%），中國藥科大學劉靜涵教授提供，乙酰膽堿，決奈達隆，純品，Sigma；其余試劑市售，分析純。

1.1 實驗動物和分組

雄性SD大鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物中心，合格證號SCXK（滬）2008-0016。隨機分組，實驗設正常，造模，治療組。 正常組大鼠10只，iv 生理鹽水7d。其余大鼠10%水合氯醛麻醉，尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液（0.1gCaCl2+6.6μgACh/10mLH2O，0.1mL/100g），每天一次，第四天，隨機分成①模型組、②關白附總堿鹽口服低劑量（5mg/kg）、③中劑量（15mg/kg）、④高劑量（45mg/kg）和決奈達隆組（1mg/kg，ip）。藥物治療3d。

1.2 AF 持續(xù)時間測定與ECG 參數(shù)的測量

大鼠麻醉，在ECGⅡ監(jiān)測下靜脈注射Ach-CaCl2誘發(fā)房顫，對照組大鼠麻醉后注射生理鹽水，以出現(xiàn)房顫f波及P波消失為典型房顫心電圖，以恢復竇性心律及f波消失，P波出現(xiàn)為房顫終止。計算大鼠造模后房顫持續(xù)時間。于實驗第1天，第4天和第7天造模完成30min后記錄II導聯(lián)心電圖，計算QTc。

1.3 大鼠心房肌有效不應期測定

如文獻[4]描述，每組取8只大鼠在實驗第8天進行ERP測定。

1.4 Western-blot 法測定大鼠心房組織縫隙連接蛋白Cx40的表達

造模結(jié)束后，取大鼠心房，加入RIPA裂解液（Biouniquer），剪碎勻漿離心后提取總蛋白。Bradford法定量。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃孵育一抗過夜 （兔抗Cx40一抗，美國Santa Cruz 公司；鼠抗GAPDH一抗，Bioworld公司） 。

TBST洗膜，二抗室溫搖床孵育 （HRP標記山羊抗兔二抗Biouniquer公司；HRP標記山羊抗小鼠二抗，北京原平皓生物）。HRP-ECL法顯色（ECL化學發(fā)光試劑盒，Biouniquer 公司），X線膠片感光，掃描，Quantity One 4.6.2 凝膠圖像分析軟件分析，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值計算目的蛋白的表達水平，重復三次。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 關白附 (關1)對大鼠QTc的影響（ ±s，n=6）

表2 關白附 (關1)對大鼠QTc的影響（ ±s，n=6）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs給藥前后；##P＜0.01 vs 造模第一天。

QTc D1前 D1后 D4前 D4后 D7前 D7后model 0.178±0.004 0.172±0.004 0.172±0.004 0.17±0.004*## 0.161±0.006## 0.157±0.005*##關1低 0.168±0.007 0.165±0.007 0.192±0.009## 0.187±0.009**## 0.198±0.009## 0.186±0.008**##關1中 0.183±0.009 0.174±0.007 0.196±0.006## 0.189±0.008*## 0.204±0.007## 0.184±0.01*##關1高 0.168±0.003 0.168±0.011 0.193±0.01# 0.178±0.006* 0.211±0.019# 0.193±0.005#決奈 0.172±0.006 0.171±0.004 0.198±0.006## 0.193±0.006## 0.215±0.007## 0.204±0.006*##

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠尾靜脈注射藥液（CaCl210 mg/mL，ACh 66μg/mL），誘導出典型大鼠房顫心電圖：P波消失，f波出現(xiàn)，R-R間期不等，可自行恢復竇性心率。連續(xù)造模7d，大鼠房顫持續(xù)時間逐漸延長，心房ERP縮短。關白治療組，房顫持續(xù)時間縮短，ERP延長至正常水平，見圖1、圖2和表1。

圖1 正常和房顫大鼠II導聯(lián)心電圖

表1 關白附2010至0505（關白1）對房顫大鼠左心房ERP（ms）的影響（±s，n=6）

表1 關白附2010至0505（關白1）對房顫大鼠左心房ERP（ms）的影響（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01，與正常組比較；# P＜0.05，##P＜0.01，與模型組比較

組別 正常 模型 關白1低 關白1中 關白1高 決奈ERP 77.4±5.3 65.3±3.6**78.8±2.7##80.8±2.3##81±5.3##76.3±2.9##

圖2 關白附總堿鹽對大鼠房顫時間的影響（±s，n=6）

2.2 關白附對房顫大鼠復極參數(shù)QTc和左心房ERP的影響

實驗結(jié)果見表2。大鼠造模7d，左心房ERP縮短，提示電重構(gòu)形成，關白附治療后，心房ERP有效延長，心室復極參數(shù)回復到正常水平。

2.3 房顫大鼠心房組織Cx40蛋白表達的變化

與正常組相比，模型大鼠心房肌中Cx40含量下降（P＜0.01），關白附治療組，能有效保護Cx40蛋白表達，維持心房電信號同步。Western 原始圖和表達結(jié)果如圖3所示。

圖3 關白附保護心房Cx40蛋白表達

3 討 論

AF疾病發(fā)生發(fā)展中存在“房顫致房顫”（AF begets AF）現(xiàn)象[5]，即房顫持續(xù)慢性存在，能夠引起心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，形成房顫基質(zhì)。實驗研究顯示，心房持續(xù)性顫動，可引起心房體積增大、心房纖維化等結(jié)構(gòu)改變。電重構(gòu)主要表現(xiàn)為心房有效不應期（atrial effective refractory period，AERP）縮短和不應期頻率適應性降低。心房發(fā)生電重構(gòu)后，可促使AF發(fā)作頻率增多、發(fā)作時間延長，甚至不能自行轉(zhuǎn)復。目前認為，異位興奮灶只是AF發(fā)生的觸發(fā)機制，而AF得以維持，有賴于心房電和結(jié)構(gòu)重構(gòu)的基質(zhì)即房顫基質(zhì)[6]。AF電重構(gòu)成為人們研究的熱點，本實驗以左心房ERP值作為電重構(gòu)功能性指標，觀察關白附抑制房顫引起的電重構(gòu)作用。

心電圖參數(shù)中，QT間期反映心室肌復極過程。QT間期受心率影響較大，心率加快，QT間期縮短。校正QT間期，即QTc，可消除心率引起的QT間期變化，被認為是衡量心室復極過程較可靠指標。本實驗結(jié)果顯示，持續(xù)房顫刺激，模型組大鼠心室復極加快，QTc縮短。提示房顫模型大鼠，心室電生理特性適應性改變。QT過度縮短，即SQT綜合癥，可誘發(fā)室性心律失常，是危險的心律失常發(fā)生征兆。關白附治療后，可有效延長模型大鼠QTc，恢復心室電生理特性。

細胞間縫隙連接（gap junction，GJ）作為細胞間的一種特殊通道介導著細胞間電和化學信號的傳遞，在維持電和機械偶聯(lián)，以及確保心肌協(xié)調(diào)收縮方面起著重要作用[7]?？p隙連接蛋白40（connexin40，Cx40）主要分布在心房肌，是心房電激動傳導的關鍵蛋白，Cx40表達和功能的改變，有助于維持局部微折返，導致持續(xù)性AF[7]。實驗結(jié)果提示，關白附可有效提高房顫引起的Cx40表達下調(diào)，回復心房電傳導功能。

決奈達隆2009年FDA批準上市，用于預防心房顫動或恢復竇性心率，預防室性心動過速和心室顫動[8,9]。 本實驗結(jié)果顯示，關白附治療房顫作用與決奈達隆接近，本課題組藥動學研究顯示，關白附口服片生物利用度大于80%（數(shù)據(jù)待發(fā)表），而決奈口服生物利用度僅15%，提示關白附口服制劑在抗房顫作用上具有廣闊的應用前景，值得進一步深入研究。

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