植酸酶耐熱性評(píng)價(jià)方法的研究

馬俊孝 盧彥梅 劉 偉 張贊劍 史衍魯

植酸酶是一種能水解植酸的酶類(lèi)，在提高飼料中磷的利用率、減少糞便中有機(jī)磷的排放以及降低飼料成本方面的效果已被廣泛證實(shí)[1－2]。與所有的酶制劑一樣，植酸酶對(duì)溫度、酸堿、水分及貯存等環(huán)境因素很敏感，尤其是溫度、水分對(duì)酶活性有很大的影響。畜禽飼料生產(chǎn)過(guò)程中的制粒、膨化、擠壓調(diào)質(zhì)等工序，溫度一般在70～95℃，會(huì)嚴(yán)重破壞酶的活性，從而限制酶使用。采用的微丸包被技術(shù)生產(chǎn)植酸酶是解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)現(xiàn)實(shí)、有效的方法。

市場(chǎng)上已有幾種微丸型的耐高溫植酸酶產(chǎn)品，但這種耐高溫植酸酶對(duì)飼料制粒過(guò)程的耐受性能仍然是最受關(guān)注的焦點(diǎn)。如何比較不同的耐高溫植酸酶從而選擇合適的產(chǎn)品是困擾使用者的難題。因此，有必要建立一種快速、簡(jiǎn)易的方法，有效評(píng)價(jià)飼料加工過(guò)程中植酸酶活性的損失情況具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文比較了幾種實(shí)驗(yàn)室條件下評(píng)價(jià)植酸酶耐熱性的方法，并結(jié)合飼料制粒試驗(yàn)，提出了一種簡(jiǎn)單、快速并接近飼料加工過(guò)程中酶活損失情況的植酸酶耐熱性評(píng)價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

耐高溫植酸酶為收集自國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上常見(jiàn)的幾種產(chǎn)品。

1.2 酶活力檢測(cè)

植酸酶產(chǎn)品的酶活檢測(cè)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18634—2009，采用分光光度法測(cè)定 [GB/T 18634—2009《飼用植酸酶活性的測(cè)定——分光光度法》]。酶活力定義為：樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/l、溫度為37℃、pH值為5.0的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無(wú)機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位，以U/ml（或U/g）表示。

飼料試驗(yàn)樣品中植酸酶的酶活按照劉玉慶等[3]所述方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)室條件下植酸酶的耐熱性評(píng)價(jià)

水浴法：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2000 g樣品，用少量緩沖液轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中，定容，磁力攪拌條件下浸提30 min，取上清液進(jìn)一步稀釋?zhuān)瓜♂屢好富钤?0～30 U/ml左右，取上述稀釋液10 ml置于80℃的水浴中處理5 min、10 min，取出自然冷卻，測(cè)定處理后溶液中植酸酶活性。

干熱法：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2000 g樣品于200 ml燒杯中，置于80℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中熱處理10 min，取出自然冷卻后，測(cè)定熱處理前后樣品的酶活。

濕熱法：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2000 g樣品放入200 ml燒杯中，置于手提式高壓蒸汽消毒器內(nèi)，蓋上蓋，用飽和水蒸汽處理2 min或更長(zhǎng)時(shí)間（蒸汽溫度從初始的99℃至結(jié)束時(shí)的110℃），取出后自然冷卻，分別測(cè)定處理前后的酶活。用蒸汽處理酶樣品時(shí)要防止冷凝水滴入燒杯中。

植酸酶的耐熱性能以酶活的殘存率來(lái)表述，以處理后與處理前植酸酶樣品的酶活比值(%)來(lái)表示，所有數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定結(jié)果的平均值。

1.4 飼料加工過(guò)程對(duì)酶活力的影響

耐高溫植酸酶的飼料中制粒試驗(yàn)在山東六和集團(tuán)的不同飼料廠(chǎng)進(jìn)行，飼料品種為肉中雞全價(jià)配合飼料511，主要飼料加工參數(shù)為：調(diào)制時(shí)間18～30 s，調(diào)制溫度70～80℃，蒸汽壓力0.4～0.5 MPa。試驗(yàn)中除去初始和結(jié)尾階段的料，在生產(chǎn)線(xiàn)上均勻間隔地分別采集混合及成品各12個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)定，取12個(gè)測(cè)定值的平均值。植酸酶的耐熱性能以成品顆粒飼料中酶活與飼料生產(chǎn)前的混合原料中酶活的比值來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同評(píng)價(jià)方法對(duì)植酸酶耐熱性的影響

收集市場(chǎng)上常見(jiàn)的2種耐高溫植酸酶產(chǎn)品，根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)，用實(shí)驗(yàn)室方法及實(shí)際飼料制粒試驗(yàn)以考察耐高溫植酸酶的酶活力殘留情況，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，用不同的評(píng)價(jià)方法考察同一個(gè)植酸酶的耐熱性時(shí)結(jié)果相差非常大，水浴法評(píng)價(jià)條件下酶活損失最多，而干熱條件下酶的損失很少，濕熱法的結(jié)果介于水浴法和干熱法之間。幾種實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)方法中，濕熱法與實(shí)際飼料制粒試驗(yàn)結(jié)果最為接近。

表1 不同評(píng)價(jià)方法下植酸酶的耐熱性(%)

2.2 濕熱法處理時(shí)間的優(yōu)化

表1中，濕熱法處理后的酶活損失最接近于實(shí)際飼料制粒后的酶活損失情況，可以用濕熱法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室條件下植酸酶的耐熱性評(píng)價(jià)。但是，濕熱法與實(shí)際飼料制粒情況有一定的偏差。因此，對(duì)濕熱法處理時(shí)間作適當(dāng)延長(zhǎng)。選擇3種自制的微丸型耐高溫植酸酶樣品，用濕熱處理不同時(shí)間，酶的耐熱性結(jié)果如表2所示。表2中，濕熱處理2 min時(shí)，3個(gè)酶樣品的耐熱性差別不大，而濕熱處理2.5 min時(shí)耐熱性大幅降低，而且3個(gè)樣品的耐熱性顯示了較明顯的差異，同時(shí)濕熱處理2.5 min耐熱性評(píng)價(jià)結(jié)果與飼料制粒試驗(yàn)結(jié)果更加接近。

表2 濕熱法處理不同時(shí)間下植酸酶的耐熱性表現(xiàn)(%)

然而，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行飼料制粒時(shí)，濕熱評(píng)估法需要再次延長(zhǎng)蒸汽處理時(shí)間。筆者選擇自制的包衣微丸型植酸酶樣品F、G、H以及I，用濕熱法進(jìn)行耐熱性能的評(píng)價(jià)，結(jié)果如表3所示。

表3 濕熱法處理不同時(shí)間下植酸酶的耐熱性表現(xiàn)(%)

由表3可知，調(diào)質(zhì)溫度更高（80℃）、調(diào)質(zhì)時(shí)間更長(zhǎng)（30 s）、蒸汽壓力更大（0.5 MPa）的飼料加工過(guò)程，對(duì)酶的損傷更大，因此，在所述試驗(yàn)條件下，濕熱法3 min的處理結(jié)果更接近于飼料加工過(guò)程中酶活損失的實(shí)際情況。

3 討論

隨著飼料廠(chǎng)越來(lái)越多地采用高溫短時(shí)加工設(shè)備，如制粒機(jī)、膨化機(jī)、深度調(diào)質(zhì)器以及通用熟化制粒機(jī)等，飼料中的酶制劑等熱敏性組分受到不同程度的破壞。改進(jìn)熱敏性添加劑的生產(chǎn)和使用工藝成為近年來(lái)添加劑和飼料工業(yè)的一項(xiàng)重要工作，目前，通過(guò)提高植酸酶的添加量來(lái)彌補(bǔ)因酶活力損失造成的有效值不足，或通過(guò)微丸包被技術(shù)、基因工程方法改良發(fā)酵菌株等手段，一定程度上減輕了飼料加工過(guò)程對(duì)酶的損害。盡管如此，高溫、高濕的飼料加工環(huán)境對(duì)植酸酶活性仍然有不可避免的影響，有效評(píng)價(jià)飼料加工過(guò)程中植酸酶活性的損失具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，實(shí)驗(yàn)室條件下評(píng)價(jià)植酸酶熱穩(wěn)定性常用的方法有干熱法、水浴法和濕熱法。干熱法是將植酸酶置于干燥箱中，然后在一定的溫度下處理一定時(shí)間，測(cè)定植酸酶活性損失的方法。已有的實(shí)踐表明，由于沒(méi)有水分因素的影響，大多數(shù)植酸酶對(duì)干熱環(huán)境都有較好的耐受性，干熱法對(duì)酶的耐熱性評(píng)估結(jié)果遠(yuǎn)比實(shí)際飼料制粒結(jié)果要高。本試驗(yàn)中干熱條件下酶活損失只有5%左右，與其他研究者的報(bào)道類(lèi)似[4－5]。

水浴法是在水浴鍋中對(duì)植酸酶溶液在一定溫度下進(jìn)行水浴保溫來(lái)評(píng)估酶的耐熱性能，所得到的酶活殘留率要比實(shí)際值低得多。水浴法將酶樣品溶解在水溶液中，使酶蛋白完全暴露在較高溫度的水環(huán)境中，實(shí)際是在評(píng)價(jià)酶蛋白的耐熱性能，而不是酶產(chǎn)品的耐熱性，因此水浴法對(duì)包衣和未包衣植酸酶產(chǎn)品的評(píng)估差異較大，與飼料加工過(guò)程中酶的實(shí)際損失相差甚遠(yuǎn)。本研究中，樣品A是包衣產(chǎn)品，水浴法檢測(cè)時(shí)幾乎沒(méi)有耐熱性，然而實(shí)際耐熱性達(dá)67%，而未包衣的樣品B卻相反（見(jiàn)表1）。

濕熱法在干熱法基礎(chǔ)上加入濕度的因素，使其更接近實(shí)際的飼料調(diào)質(zhì)和制粒情況。已報(bào)道的濕熱法一般需先測(cè)定植酸酶樣品中水分含量，然后據(jù)其水分含量均勻添加純化水調(diào)節(jié)待處理樣品水分至17%左右（飼料調(diào)質(zhì)時(shí)的水分含量一般在16%～18%），再置于恒溫箱或水浴中處理一定時(shí)間[4,6]。這種評(píng)估結(jié)果能很好地反映飼料在實(shí)際加工過(guò)程中酶活損失的情況。但是，在含有一定水分的酶樣品（一般水分低于8%）中均勻、準(zhǔn)確地添加水分至17%，這個(gè)試驗(yàn)操作是一個(gè)難題。因此，這種濕熱法雖然有效但不是一種簡(jiǎn)單、快捷的評(píng)估手段。文中所述濕熱法在蒸汽消毒器中進(jìn)行濕熱處理，操作簡(jiǎn)單、快捷，而且檢測(cè)的重復(fù)性好，是一種相對(duì)有效的實(shí)驗(yàn)室植酸酶熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)方法。

不同飼料廠(chǎng)由于設(shè)備、飼料配方、加工工藝等的差異，飼料制粒過(guò)程中的調(diào)質(zhì)溫度、調(diào)制時(shí)間、蒸汽壓力、環(huán)?？讖降葏?shù)有較大的差異。對(duì)于某一種植酸酶的耐熱性評(píng)價(jià)，需要針對(duì)不同的飼料調(diào)質(zhì)、制粒參數(shù)，在濕熱蒸汽處理時(shí)間上要做出適當(dāng)調(diào)質(zhì)，使評(píng)估方法更接近于特定飼料廠(chǎng)生產(chǎn)的實(shí)際。顯然，對(duì)于比較不同植酸酶之間耐熱性能的優(yōu)劣而言，從筆者在不同飼料廠(chǎng)的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，相同條件下濕熱蒸汽處理2.5～3 min能得出各個(gè)植酸酶的耐熱性差別，并且與飼料生產(chǎn)的實(shí)際酶活損失情況較為接近。

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