葉金明 金立志 鄭宗林
植物提取物是芳香、揮發(fā)性化合物的混合物,根據(jù)植物材料的芳香特性而命名并由這些植物提取獲得。止痢草(牛至)植物提取物(香芹酚和百里香酚)、肉桂植物提取物(肉桂醛)、麝香草屬植物提取物(麝香草酚)和蕓香料灌木提取物(甲基紫羅蘭酮)等4種植物提取物的純化成分已有較多研究和報(bào)道,很多研究報(bào)道了肉桂屬、麝香草屬和止痢草植物提取物具有廣泛的體外抗微生物活性。揭示了植物提取物主要成分的體外抗微生物活性是源于植物精油的活性作用。金立志(2007)綜述了一些植物提取物的研究及應(yīng)用情況。在抗菌方面,止痢草提取物抗菌能力較強(qiáng),特別是止痢草提取物性質(zhì)穩(wěn)定易于使用。但對(duì)于止痢草提取物在水產(chǎn)動(dòng)物中抗菌性能的研究還未見報(bào)道。嗜水氣單胞菌是淡水魚流行性敗血癥的主要致病菌。本試驗(yàn)對(duì)羅非魚進(jìn)行嗜水氣單胞菌攻毒,同時(shí)飼料中拌喂止痢草提取物,通過組織切片和電鏡觀察等手段觀察感染嗜水氣單胞菌的羅非魚組織器官的病變情況,及止痢草提取物對(duì)組織器官的保護(hù)、抗菌性能。
1.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)用吉富品系尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)購自重慶市銅梁縣溫泉漁場(chǎng)。試驗(yàn)開始前停飼24 h,選擇體重接近(22.0±1.0)g的幼魚 90尾,隨機(jī)分配于9個(gè)養(yǎng)殖缸,具體分組見表1。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.1.2 試驗(yàn)飼料
采用羅非魚常規(guī)商業(yè)配方,具體日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。
1.1.3 注射感染
各組投喂相應(yīng)的飼料3周后,以腹腔注射的方式使羅非魚感染嗜水氣單胞菌。試驗(yàn)菌株取自上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)植物病原庫,菌株號(hào):ST 78-3-3。將嗜水氣單胞菌涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上,28℃下培養(yǎng)過夜,以制備菌懸液。梯度稀釋制備菌懸液:用0.9%的無菌生理鹽水將嗜水氣單胞菌從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上洗下菌落,采用活菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法計(jì)菌數(shù),推算出菌懸液的活菌數(shù),并將上述懸液稀釋得到107cfu/ml。陰性對(duì)照組每尾魚注射0.1 ml無菌生理鹽水,陽性對(duì)照組、OS組每尾魚注射0.1 ml的菌懸液(107cfu/ml)。注射后168 h取陽性對(duì)照組和OS組病癥明顯、但未死亡的羅非魚,及從陰性對(duì)照組隨機(jī)取魚,分離各組織器官固定,每組取3尾。
表2 羅非魚基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平(%)
1.2.1 Bouin's固定液
飽和苦味酸水溶液75 ml、福爾馬林25 ml和冰醋酸5 ml混合均勻保存于陰暗處。
1.2.2 Ehrlich氏蘇木精染色液
混合50 ml純酒精與5 ml冰醋酸,然后將1 g蘇木精溶解其中,并加入50 ml甘油。另將5 g鉀明礬(硫酸鋁鉀)加入50 ml蒸餾水內(nèi)加熱使其溶解,再慢慢傾入上述已配制的混合液,隨之?dāng)嚢琛_^濾后靜置2~4周后尚能成熟,也可加入雙氧水以縮短成熟的時(shí)間。
1.2.3 伊紅染色液
0.5g固體伊紅溶解在100 ml 95%的酒精中,加熱后磁力攪拌器攪拌使其充分溶解。
1.2.4 0.1 M磷酸鹽緩沖溶液(PBS)pH值7.3(sorensen配方)
A液為0.2 M磷酸二氫鈉水溶液(27.6 g NaH2PO4·H2O或31.21 g NaH2PO4·2H2O溶于1000 ml雙蒸水);B液為0.2 M磷酸氫二鈉水溶液(35.61 g Na2HPO4·2H2O 或71.64 g Na2HPO4·12H2O溶于1000 ml雙蒸水)。A液與B液按23:67體積比例混合。
1.2.5 二甲砷酸鹽緩沖液
A 液(0.4 M 二甲砷酸鈉貯存液):Na(CH3)2·AsO2·3H2O 8.65 g溶于1000 ml雙蒸水。
B液(0.2 M 鹽酸溶液):HCl(36%~38%)1 ml,加雙蒸水到60 ml。
取25 ml A液、3~4 ml B液混合,測(cè)pH值,可用B液調(diào)pH值到7.3左右,再加雙蒸水到50 ml,配成的二甲砷酸鈉濃度為0.2 M。最后配成的固定液中加入1~3 mM的鈣離子,可使結(jié)構(gòu)保存更好。
1.2.6 Palade醋酸—巴比妥緩沖液(Palade配方)
A液(巴比妥鈉2.89 g、無水醋酸鈉1.15 g溶解于100 ml雙蒸水中);B 液[HCl(36%~38%)8.6 ml,加雙蒸水到1000 ml]。臨用時(shí)按下列比例混合:A液5 ml、B液5 ml(調(diào)整B液的量可得到所需的pH值)、雙蒸水15 ml。
1.2.7 2%鋨酸(四氧化鋨)固定液貯存液的配制
先將4只裝有四氧化鋨的安瓿(共2 g)用肥皂水洗凈,再用洗潔液浸泡過夜,自來水沖洗干凈后,用玻璃劃割器在上面劃痕,再用蒸餾水沖洗幾次,放入潔凈棕色廣口玻璃瓶?jī)?nèi),加上100 ml雙蒸水,用潔凈玻璃棒搗破安瓿,或用力搖破。然后用蠟嚴(yán)密封口,貼上標(biāo)簽備用。洗凈后的安瓿嚴(yán)禁與手或紗布、濾紙等接觸。將配好的2%四氧化鋨置于干燥器中,于4℃保存。
1.2.8 磷酸緩沖的四氧化鋨固定液的配制
等量的0.1 M磷酸緩沖液(pH值7.3)與2%四氧化鋨貯存液混合,臨用時(shí)現(xiàn)配。
1.2.9 二甲砷酸鹽緩沖的四氧化鋨固定液的配制
等量的0.2 M二甲砷酸鹽緩沖液(pH值7.3)與2%四氧化鋨貯存液混合,臨用時(shí)現(xiàn)配。
1.2.10 Palade醋酸—巴比妥鈉緩沖的四氧化鋨固定液的配制
取Palade醋酸—巴比妥鈉緩沖5.0 ml與12.5 ml的2%四氧化鋨貯存液混合,再分別加入0.1 M的鹽酸5.0 ml、雙蒸水2.5 ml即可。
1.3.1 組織固定
分別取人工感染試驗(yàn)中發(fā)病羅非魚和對(duì)照組存活的健康羅非魚的鰓、肝臟、心臟、腹神經(jīng)節(jié)等組織器官,按照龔志錦的方法Bouin's固定液固定24 h以上,保存。
1.3.2 水洗及脫水
倒掉固定液后用微流水洗滌過夜。依次經(jīng)30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%及 100%酒精兩次脫水處理,每級(jí)脫水時(shí)間30 min。
然后經(jīng)過透明、透蠟和包埋處理,最后進(jìn)行切片與烘片。常溫下切片,切片厚度10 μm。每個(gè)組織塊切20片,蛋白膠固定。展片臺(tái)上展片后放入37℃烘箱中烘72 h。
在58℃烘箱中經(jīng)二甲苯20 min兩次脫蠟后放入 1:1二甲苯與純酒精 5~10 min后依次放入100%、95%、90%、80%、70%、50%、30%的酒精中進(jìn)行處理,每級(jí)5~10 min,然后放入純水中處理5~10 min。
經(jīng)蘇木精染色,切片脫水及伊紅復(fù)染,最后進(jìn)行切片透明及中性樹膠封片,并采用OLYMPUS顯微鏡觀察和拍片。
取羅非魚肝臟進(jìn)行組織超薄切片的制作。超薄切片按照常規(guī)方法進(jìn)行制作,即組織塊經(jīng)戊二醛—鋨酸雙固定,梯度酒精脫水,環(huán)氧樹脂Epon 812包埋,Leica超薄機(jī)超薄切片,醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙染色法染色后,使用日立H-6000型透射電鏡觀察并且拍照。
羅非魚腹腔注射嗜水氣單胞菌后,主要癥狀為攝食量下降,活動(dòng)能力減弱。48 h后腹部出現(xiàn)增大,腹腔注射部位紅腫,口部、各鰭基部、鰓蓋及鰓裂后部均有出血癥狀,眼球外突。部分羅非魚鰓蓋凹陷,鰓絲發(fā)白,肛門紅腫呈瀕死狀態(tài)。解剖后觀察可見肝胰臟呈土黃色,心、脾顏色暗紅,腸道少或無食物。各種癥狀表明,嗜水氣單胞菌對(duì)羅非魚肝、腎、脾、心、腸、鰓都造成不同程度的破壞,特別是對(duì)肝、腎和鰓的破壞程度較大。
電鏡照片主要觀察了肝細(xì)胞的重要器官線粒體的形態(tài)變化。與陰性對(duì)照組相比,超薄切片OS組的肝細(xì)胞內(nèi)可見部分線粒體的內(nèi)嵴折疊、變形甚至斷裂,失去正常的船梁結(jié)構(gòu),同時(shí)可見髓樣小體腫脹,部分腫脹破裂(見圖1-A)。而陽性對(duì)照則病變更加嚴(yán)重,某些組織壞死成一片無結(jié)構(gòu)的區(qū)域(見圖1-C),而圖1-B為正常的線粒體,圖1-D為嗜水氣單胞菌的電鏡照片。
2.3.1 肝臟
正常羅非魚肝臟由無數(shù)肝小管組成。大體分為兩瓣,呈三葉狀,每一葉由許多小的分支的盲管組成,這些盲管通到每一葉的收集管,這三葉的收集管通過肝臟的主導(dǎo)管與中腸聯(lián)系。每一肝小管都是由位于基膜上的單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成,細(xì)胞間界線清晰(見圖2-A)。OS組的羅非魚,其肝細(xì)胞部分水腫、變性,細(xì)胞排列可見輕度紊亂,部分細(xì)胞核壞死消失;隨后肝小管上皮細(xì)胞間界線消失,細(xì)胞壞死,見壞死物脫落入肝小管管腔(見圖2-B);陽性對(duì)照組的羅非魚肝細(xì)胞病變更加嚴(yán)重,可見肝小管上皮增生,核大小不一,有的細(xì)胞水腫變性,細(xì)胞核固縮、碎裂或崩解(見圖2-C)。
圖1 肝細(xì)胞超顯微病理
圖2 肝臟及鰓顯微病理
2.3.2 鰓
正常羅非魚每條鰓由一扁平的鰓軸及其向兩邊發(fā)出的許多鰓葉組成。鰓葉最外面是角質(zhì)層,向內(nèi)是上皮細(xì)胞層,中間是鰓腔。上皮細(xì)胞向鰓腔突起形成隔,將鰓腔分成許多小通道,其內(nèi)常有大而胞質(zhì)著色淺的細(xì)胞,通道內(nèi)有游離的血細(xì)胞(見圖2-D)。OS組的羅非魚的鰓也發(fā)生病變,并且在不同患病個(gè)體中,隨病情的嚴(yán)重程度不同其組織病理學(xué)變化也有所不同,鰓組織中出現(xiàn)細(xì)胞濁腫,鰓肌開始變性(見圖2-E)。而陽性對(duì)照組的羅非魚鰓葉上皮細(xì)胞及柱細(xì)胞廣泛變性,大部分區(qū)域出現(xiàn)細(xì)胞壞死,鰓葉腔擴(kuò)張(見圖2-F)。
過去10年,水產(chǎn)養(yǎng)殖在全球范圍內(nèi)以高于30%的速度迅猛發(fā)展,進(jìn)而成為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域增長(zhǎng)最快的部分之一,但魚蝦疾病的頻發(fā)態(tài)勢(shì)嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展。鑒此,疫苗開發(fā)、水質(zhì)調(diào)控以及飼料添加劑和藥物(如抗生素)等都以極快的速度應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域,成為預(yù)防和控制水產(chǎn)動(dòng)物疾病發(fā)生的有效手段。抗生素類產(chǎn)品已經(jīng)在人類和畜禽動(dòng)物的疾病預(yù)防與控制中得到廣泛的使用,而抗生素類產(chǎn)品在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用卻出現(xiàn)了一些問題,這主要是與水產(chǎn)動(dòng)物的給藥方式有關(guān)。水產(chǎn)養(yǎng)殖往往采用高密度、集約化養(yǎng)殖模式,考慮到養(yǎng)殖對(duì)象的特殊性,無論預(yù)防還是治療水產(chǎn)動(dòng)物群體,實(shí)行個(gè)體給藥都是不可行的,群體藥飼和藥浴成為僅有的兩種備選給藥方案,但這兩種給藥方法都可能造成抗生素給藥濃度的不穩(wěn)定性。這種不穩(wěn)定的給藥濃度變化可使魚類長(zhǎng)時(shí)間接觸到低于治療劑量的抗生素藥物濃度,長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)這種狀態(tài)可能導(dǎo)致水體和水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的病原菌產(chǎn)生針對(duì)某些抗生素耐藥菌株。耐藥菌株的存在可能對(duì)養(yǎng)殖者和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物造成嚴(yán)重的不良后果。
植物提取物飼料添加劑由一系列的植物生物活性成分及其衍生物構(gòu)成,長(zhǎng)期以來就被當(dāng)作香料、防腐劑和藥材使用。精油提取物是植物源提取物的核心成分,是一類芳香、揮發(fā)性化合物的混合物,植物原料常據(jù)其芳香特征來加以區(qū)分。精油是疏水性的化合物,包括醇、醛、酯、醚、酮、酚、萜等化學(xué)成分。精油分子結(jié)構(gòu)中的六碳環(huán)會(huì)在植物的生長(zhǎng)及動(dòng)物攝食的過程中生成不同的生化組分,從而產(chǎn)生不同的生化功能。植物提取物類飼料添加劑被認(rèn)定為“安全、高效、穩(wěn)定、可控”的飼料添加劑,逐漸成為綠色環(huán)保安全動(dòng)物食品生產(chǎn)和飼料工業(yè)充滿活力的新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。
對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物胃腸道對(duì)大量的刺激都反應(yīng)敏銳,這些應(yīng)激可能導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞的破壞,其屏障功能受損,從而進(jìn)一步影響食物的消化吸收機(jī)能。酚的抗菌效果主要是對(duì)目標(biāo)細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響,酚類物質(zhì)作用于細(xì)胞壁,改變其對(duì)H+和K+的離子通透性。研究發(fā)現(xiàn),精油會(huì)抑制革蘭氏陰性菌的代謝產(chǎn)物的活性,因?yàn)槠浞肿雍苄?,能夠通過外膜蛋白孔,進(jìn)入質(zhì)膜。萜類化合物和苯基丙烯類化合物的親脂性使其能穿過細(xì)菌的細(xì)胞膜達(dá)到細(xì)胞內(nèi)部。精油還可促進(jìn)消化酶的活性提高,促進(jìn)脂質(zhì)代謝和脂肪的消化吸收。關(guān)于植物精油的作用機(jī)制目前有幾種不同的理論,比如直接減少腸道菌群、刺激乳酸菌的產(chǎn)生、增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫機(jī)能。不論對(duì)陸生動(dòng)物還是水生動(dòng)物,保持其消化道健康至關(guān)重要。眾多研究已證明硬骨魚類消化道相關(guān)淋巴組織(GALT)的存在。GALT是由淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等組成的復(fù)雜系統(tǒng)??梢酝茰y(cè),植物源添加劑和魚類免疫功能的正常發(fā)揮有較好的協(xié)同作用,但這一作用的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步的科學(xué)研究。
本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后,羅非魚的鰓和肝臟等實(shí)質(zhì)器官都發(fā)生了較嚴(yán)重的病變。但經(jīng)過3周投喂含止痢草提取物,試驗(yàn)組羅非魚的鰓和肝臟病變情況有明顯緩解。如果持續(xù)數(shù)周添加,則可能恢復(fù)到正常。
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