芽孢桿菌和低聚木糖對凡納濱對蝦生長和消化酶活力的影響

陳曉瑛 曹俊明 王國霞 黃燕華 張榮斌 黃文慶 嚴(yán) 晶 劉群芳

近年來，凡納濱對蝦的養(yǎng)殖在中國得到了快速發(fā)展。2009年養(yǎng)殖產(chǎn)量超過110萬噸，占甲殼動物養(yǎng)殖產(chǎn)量的37%。但隨著對蝦集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，水環(huán)境惡化導(dǎo)致病害頻繁，大量抗生素及其它違禁藥物用于病害防治，引起細(xì)菌抗藥性及藥物殘留等問題，已嚴(yán)重影響了對蝦產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。為了解決養(yǎng)殖病害和食品安全等諸多矛盾，減少抗生素的使用是目前的研究熱點。

鑒于抗生素大量使用導(dǎo)致了腸道菌群的失衡、藥物殘留、耐藥性及傳遞和轉(zhuǎn)移等負(fù)效應(yīng)，采用益生菌和益生元兩者配伍使用的合生元以減少抗生素的使用量成為飼料添加劑研究熱點之一。功能性寡糖（益生元）和有益的活體微生物（益生菌）是微生態(tài)制劑的主要種類。芽孢桿菌和低聚木糖分別屬于益生素和益生元，用量少、穩(wěn)定性好、耐酸堿，可適當(dāng)減少抗生素的使用，已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。芽孢桿菌作為一種益生菌不但可以通過分泌抑制物、競爭營養(yǎng)、競爭粘附位點和生物奪氧來抑制有害菌的增殖，維持腸道微生態(tài)平衡，而且可分泌維生素、消化酶等營養(yǎng)物質(zhì)，改善水產(chǎn)品品質(zhì)及凈化水質(zhì)。低聚木糖是一種功能性寡糖類益生元。與其他低聚糖相比，低聚木糖具有穩(wěn)定性好、更加不易被消化酶分解，對雙歧桿菌等有益菌有更高的選擇性，在較寬的pH值范圍（pH值2.5～8.0）內(nèi)穩(wěn)定，是目前發(fā)現(xiàn)有效用量最小的低聚糖。目前，低聚木糖在畜禽養(yǎng)殖上的使用已有相關(guān)報道，飼料中添加低聚木糖能促進(jìn)養(yǎng)殖動物的生長，促進(jìn)雙歧桿菌等動物體內(nèi)有益菌增殖、抑制有害菌繁殖。益生元為益生素提供營養(yǎng)物質(zhì)，益生素可為益生元提供消化酶，兩者同時使用（合生元）時，可以延長飼用微生物的保存時間。目前，合生元的應(yīng)用主要集中在畜禽上，在肉雞、斷奶仔豬上主要是關(guān)于腸道菌群的研究；而在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用還比較少。劉波等(2006)研究了地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和低聚木糖對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio）的生長性能、消化酶活力和腸道菌群的影響。周環(huán)等(2010)研究了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）與低聚木糖組合對中華鱉（Trionyx sinensis）生長、消化酶活力及血液生化指標(biāo)的影響。目前，在飼料中同時添加芽孢桿菌和低聚木糖應(yīng)用于凡納濱對蝦的研究還未見報道，為此，本試驗研究了飼料中添加芽孢桿菌或/和低聚木糖對凡納濱對蝦生長和消化道酶活力的影響，以期為芽孢桿菌和低聚木糖在凡納濱對蝦配合飼料中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

低聚木糖由江蘇康維生物有限公司提供，有效成分為35%。芽孢桿菌由山東一家微生物技術(shù)有限公司提供。維生素預(yù)混料和礦物質(zhì)預(yù)混料由廣州飛禧特水產(chǎn)科技有限公司提供。

1.2 飼料配方及制備

以魚粉、豆粕和花生粕為主要蛋白源，魚油、大豆磷脂為主要脂肪源，高筋面粉為主要糖源，配制蛋白質(zhì)和脂肪水平分別為41.8%和6.0%的基礎(chǔ)飼料，其配方和營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)成分(%)

在基礎(chǔ)飼料中按下列水平添加芽孢桿菌（cfu/g）和低聚木糖（mg/kg）配制 6 種試驗飼料：0+0(G0)、108+0(G1)、1010+0(G2)、0+1400(G3)、108+1400(G4)和 1010+1400(G5)。芽孢桿菌和低聚木糖以等量替代高筋面粉的方式，先溶于水，再添加到飼料原料混合物中。飼料原料經(jīng)粉碎后過80目篩，微量成分采取逐級擴大法添加，逐級混勻后，用SLX－80型雙螺桿擠壓機制成直徑為1.5 mm的顆粒料，55℃烘干后于－20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗蝦及飼養(yǎng)管理

凡納濱對蝦購自正大水產(chǎn)（珠海）有限公司。飼養(yǎng)試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所水產(chǎn)品研究中心室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。試驗水源為經(jīng)沙濾、消毒后的海水和自來水混合后的咸淡水，鹽度為5.0‰～6.5‰，玻璃纖維缸容積為350 L（直徑80 cm、高70 cm、水體容積300 L），進(jìn)水速率為1.4 L/min。試驗期間以自然光為光源，光周期為自然光周期，水溫為28.5～32.0 ℃，pH 值 7.8～8.0，溶氧＞6 mg/l，氨氮≤0.1 mg/l，亞硝酸鹽≤0.01 mg/l。試驗蝦先在室外循環(huán)水泥池中馴養(yǎng)2周，然后選擇840尾體重（0.78±0.02）g的凡納濱對蝦隨機分成6組，每組設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)35尾蝦，分別投喂6種飼料，記為G0（對照組）、G1、G2、G3、G4和G5，養(yǎng)殖期為6周。采用飽食投喂法，每天在 8:00、13:00、18:00、22:30分 4次投喂，各時間投喂量占日總投餌量的比值分別為20%、20%、30%、30%，投喂半小時后收集殘餌。每天觀察對蝦健康狀況，記錄死亡情況。

1.4 樣品采集與處理

養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，禁食24 h，稱重，統(tǒng)計存活率。每個重復(fù)隨機取5尾蝦，用于測定全蝦水分、灰分、粗蛋白和粗脂肪含量。

將采血后的對蝦置于冰盤內(nèi)玻璃平面皿上解剖，取出蝦的胃、腸道和肝胰腺，然后剪開胃和腸道，用生理鹽水清洗胃、腸道內(nèi)容物，濾紙吸干后分別稱重。將胃、肝胰腺、腸道樣本，按其質(zhì)量分別加入10～15倍體積（W/V）預(yù)冷生理鹽水，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿，取部分勻漿液直接用于測定脂肪酶活力，其余部分5000 r/min、4℃離心10 min，然后立即取上清液（即酶粗提取液）置于－20℃冰箱中保存，用于測定蛋白酶和淀粉酶活性。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 飼料和蝦體成分

水分、灰分、粗蛋白和粗脂肪均按國標(biāo)方法進(jìn)行測定。

1.5.2 生長指標(biāo)計算

增重率(%)=[（終末體重－初始體重）/初始體重]×100；

存活率(%)=(試驗結(jié)束時蝦尾數(shù)/試驗開始時放蝦尾數(shù))×100；

特定生長率(%/d)=[（ln終末平均體重－ln初始平均體重）/飼養(yǎng)天數(shù)]×100；

飼料系數(shù)=總體重增加量/總飼料投喂量；

蛋白質(zhì)效率(%)=[（終末蝦體蛋白含量－初始蝦體蛋白含量）/（攝入飼料重量×飼料蛋白質(zhì)含量）]×100。

1.5.3 消化酶測定

蛋白酶活力按Folin－酚法，在一定溫度和pH值條件下，底物酪蛋白濃度為5 mg/ml，1 g鮮活組織內(nèi)蛋白酶1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個蛋白酶活力單位(U)。

淀粉酶活力按3,5－二硝基水楊酸顯色法（DNS法），在一定溫度和pH值條件下,以可溶性淀粉為底物，1 g鮮活組織內(nèi)淀粉酶1 min水解淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖的酶量為1個淀粉酶活力單位(U)。

脂肪酶活性按聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法,在一定溫度和pH值條件下,以聚乙烯醇橄欖油為底物，1 g鮮活組織內(nèi)脂肪酶1 min水解脂肪產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶量為1個脂肪酶活力單位(U)。

以上酶的活性以比活力表示：

比活力(U/mg prot)=酶活力/蛋白質(zhì)含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。采用SPSS14.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，對數(shù)據(jù)作單因素方差分析（One－way ANOVA），若處理間差異顯著，再用Duncan's法多重比較。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 試驗蝦的生長性能、存活率和飼料利用情況(見表2)

表2 芽孢桿菌和低聚木糖對凡納濱對蝦生長性能、存活率和飼料系數(shù)的影響

單獨添加芽孢桿菌（G1和G2組）和單獨添加低聚木糖（G3組）試驗組對蝦蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組（G0組）（P＜0.05），在 G1組達(dá)到最高。而聯(lián)合添加組G5顯著低于G0組（P＜0.05）。在同一芽孢桿菌水平下，G4和G5組的蛋白質(zhì)效率分別顯著低于G1和G2組（P＜0.05）。與 G0組相比，G1、G2和 G3組對蝦的增重率、特定生長率不同程度升高，飼料系數(shù)降低，其中G1組的效果最好。與G0組相比，G1對蝦的增重率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率分別提高了10.2%、3.0%和16.2%，飼料系數(shù)降低了7.3%。G4和G5組對蝦的增重率、特定生長率低于G0組，顯著低于G1組，飼料系數(shù)高于對照組。在同一芽孢桿菌水平下，G4組的增重率和特定生長率顯著低于G1組（P＜0.05），而飼料系數(shù)顯著高于G1組（P＜0.05）。所有試驗蝦的存活率為76.4%～88.6%，其中最高的為G3組，其次為G1組，均顯著高于G0和G4、G5組（P＜0.05）。

2.2 試驗蝦的全蝦體成分(見表3)

與G0組相比，隨著芽孢桿菌水平的增加，全蝦粗蛋白、粗脂肪含量升高，灰分含量降低，其中G1組對蝦粗脂肪含量顯著升高（P＜0.05）；各試驗組全蝦灰分含量顯著低于G0組（P＜0.05）。在同一芽孢桿菌水平下，G4和G5組的對蝦粗脂肪含量分別顯著低于G1和G2組（P＜0.05）；隨著添加芽孢桿菌含量的增加，試驗組中全蝦粗蛋白含量呈現(xiàn)升高的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。而在同一低聚木糖水平下，與單獨添加低聚木糖組（G3）相比，聯(lián)合添加G4組對蝦粗脂肪含量升高，灰分含量降低。

表3 芽孢桿菌和低聚木糖對凡納濱對蝦全蝦營養(yǎng)成分的影響(%)

2.3 各組對蝦的消化酶活力

飼料中添加芽孢桿菌和低聚木糖對凡納濱對蝦胃、腸道和肝胰腺消化酶活性的影響見表4。與G0組相比，G1和G2組對蝦肝胰腺淀粉酶活力增高，腸道、胃消化酶活力和肝胰腺蛋白酶和脂肪酶活力顯著升高。與G0組相比飼料中添加低聚木糖（G3組）能顯著提高對蝦肝胰腺的消化酶活力（P＜0.05），顯著降低對蝦腸道和胃的脂肪酶活力（P＜0.05）。腸道和胃蛋白酶和淀粉酶的活力差異不顯著（P＞0.05）。與G0組相比，聯(lián)合添加組（G4和G5組）對蝦肝胰腺消化酶活力、腸道蛋白酶和胃淀粉酶活力顯著升高（P＜0.05）。在同一低聚木糖水平下，隨著芽孢桿菌添加水平的升高，對蝦腸道各消化酶活力呈現(xiàn)上升的趨勢。

表4 芽孢桿菌和低聚木糖對凡納濱對蝦消化器官主要消化酶活性的影響(U/mg prot)

3 討論

3.1 芽孢桿菌和低聚木糖對凡納濱對蝦生長性能的影響

研究表明，飼料中添加芽孢桿菌能促進(jìn)水產(chǎn)動物如牙鲆（Paralichthys olivaceu）、大菱鲆（Scophthlmus maximus）、鯉魚（Cyprinus carpio）、銀鯽（Carassius auratus）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）和凡納濱對蝦的生長。本試驗結(jié)果表明，飼料中單獨添加芽孢桿菌和低聚木糖能不同程度地提高凡納濱對蝦的增重率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率，降低飼料系數(shù)，這與上述報道的結(jié)果相似。關(guān)于其作用機理，可能是芽孢桿菌在動物腸道繁殖時分泌大量消化酶，提高了動物對飼料的利用率；或者芽孢桿菌可能合成一些被宿主利用的營養(yǎng)物質(zhì)，如 VC、VB1、VB2、VB6和 VB12，并且能產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，還能降低動物腸道pH值，從而有效抑制有害菌生長，并對水產(chǎn)動物腸道有益菌的生長提供酸性條件，促進(jìn)動物的生長發(fā)育。

益生元和益生素按照適當(dāng)比例的使用在動物健康養(yǎng)殖中占有相當(dāng)重要的地位。畜禽方面對斷奶仔豬和肉雞的研究都表明，益生元和益生素聯(lián)用有一定的協(xié)同作用。而在水產(chǎn)動物的研究中，聯(lián)用芽孢桿菌和低聚木糖在異育銀鯽和中華鱉上表現(xiàn)出促生長和提高消化酶活力的作用。但也有一些報道認(rèn)為，在飼料中添加芽孢桿菌和低聚木糖不能提高動物的生長性能。本試驗結(jié)果表明，聯(lián)合添加芽孢桿菌與低聚木糖對凡納濱對蝦幼蝦生長有抑制作用，這與前人的研究不完全相同。究其原因，可能與養(yǎng)殖條件和試驗動物生長階段有關(guān)。在不同環(huán)境下，益生菌的作用效果存在差異。一般來說，養(yǎng)殖條件越惡劣，效果越明顯，且幼齡階段添加效果好于成年動物。胡毅(2007)研究表明，對初始重為（0.56±0.00）g凡納濱對蝦飼喂益生菌和寡糖的效果僅僅在前期幼體比較明顯，飼料中添加寡糖、益生菌和不同形式的配伍均不能提高對蝦后期（28～56）d的特定生長率。筆者認(rèn)為，正常情況下，低聚木糖能為凡納濱對蝦腸道中的乳酸菌和雙歧桿菌提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腸道中有益菌的生長，但是動物腸道微生物種群及其數(shù)量處于一個動態(tài)的平衡，當(dāng)飼料中同時添加低聚木糖和芽孢桿菌時，有可能使這種平衡被破壞，導(dǎo)致體內(nèi)菌群比例失調(diào)、生產(chǎn)性能下降，這與華雪銘等(2001)在動物飼料中添加過量的微生態(tài)制劑反而降低了動物生長效果的研究結(jié)果類似；另外，低聚木糖促進(jìn)生長的有益菌和飼料中添加的芽孢桿菌在腸道產(chǎn)生過量的酶，有可能影響機體內(nèi)源酶活性或者抑制內(nèi)源酶的分泌，降低內(nèi)源酶對營養(yǎng)物質(zhì)的分解作用，影響對蝦的生長；在本試驗中，對蝦初始體重為0.78 g左右，飼料營養(yǎng)水平較高，養(yǎng)殖條件較好。芽孢桿菌、低聚木糖及不同的配比對凡納濱對蝦生長性能的影響是否與生長發(fā)育階段和養(yǎng)殖條件等有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。

3.2 芽孢桿菌與低聚木糖對凡納濱對蝦體成分的影響

本試驗結(jié)果表明，飼料中添加芽孢桿菌和低聚木糖對凡納濱對蝦的水分和粗蛋白影響不顯著，但單獨添加108cfu/g芽孢桿菌時脂肪含量顯著升高。Jadamus等(2001)曾報道，芽孢桿菌可以顯著提高仔豬空腸中脂肪酶的活性，降低空腸食糜中細(xì)菌產(chǎn)生的?；悄懰峤饩勖傅幕钚裕≒＜0.05），從而促進(jìn)了脂肪的消化吸收。本研究中，單一添加芽孢桿菌能顯著提高腸道脂肪酶活性，但是否是通過腸道脂肪酶活性的升高來促進(jìn)體內(nèi)脂肪的沉積有待做進(jìn)一步研究。

3.3 芽孢桿菌與低聚木糖對凡納濱對蝦各器官消化酶活力的影響

芽孢桿菌對干燥、高溫、高壓、氧化及腸道強酸性等不良環(huán)境的抵抗力很強，能提高蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力。杜宣(2006)研究表明，飼料中添加0.1%～0.5%芽孢桿菌能顯著提高鯉魚腸道蛋白酶和淀粉酶活力，且淀粉酶活力提高更為顯著；添加由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、水生假絲酵母（Candidada quatica）和球形酵母（Saccharomyces globosus）組成的復(fù)合微生態(tài)制劑，能顯著提高鯉魚腸道和肝胰臟淀粉酶和蛋白酶活性。Wang等(2006)在鯉魚飼料中添加芽孢桿菌和光合細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)實驗組能顯著提高鯉魚腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力。劉小剛等(2002)研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加芽孢桿菌能顯著提高銀鯽腸道蛋白酶和淀粉酶活性。飼料中添加2×107個/g的枯草芽孢桿菌B11，可使魚體胃腸的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力高于對照組10%左右。Gomez等(2008)研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和納豆芽孢桿菌（B.natto）組成的復(fù)合微生態(tài)制劑能顯著提高凡納濱對蝦腸道中蛋白酶和淀粉酶活性。本試驗研究得出，飼料中單獨添加芽孢桿菌能提高凡納濱對蝦腸道、肝胰腺和胃的消化酶的活力，聯(lián)合使用芽孢桿菌和低聚木糖能顯著提高肝胰腺的消化酶活力，這與上述報道的結(jié)果相似。其可能的原因在于：①低聚木糖高選擇性地增殖雙歧桿菌，雙歧桿菌在腸道中競爭附著位點，減少有害菌，促進(jìn)腸道完整性，調(diào)高腸道自身消化酶的分泌，雙歧桿菌還可以在腸道內(nèi)合成維生素和氨基酸，為水產(chǎn)動物提供營養(yǎng)。②芽孢桿菌為好氧或兼性厭氧細(xì)菌，進(jìn)入腸道大量增殖后，產(chǎn)生生物奪氧的作用，形成并維持腸道厭氧環(huán)境，抑制有害菌的生長；枯草芽孢桿菌分泌蛋白酶和淀粉酶，對提高腸道消化酶活性有促進(jìn)作用。③芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶類，如：蛋白酶、淀粉酶和果膠酶等，而且許多酶是動物體本身不具有的酶；芽孢桿菌在動物體內(nèi)還能產(chǎn)生有效的酶促活性因子，這些活性因子提高了宿主的消化酶活性。芽孢桿菌提高動物消化酶活性是微生物飼料添加劑促進(jìn)生長作用的一個重要因素。本研究中，聯(lián)合添加芽孢桿菌和低聚木糖能提高腸道消化酶活性(腸道脂肪酶除外)，腸道的各消化酶活性與生長表現(xiàn)為有一定的相關(guān)性，但不完全一致。這與Ziaei－Nejad 等(2006)在日本對蝦、Moriarty 等(1998)在斑節(jié)對蝦及丁賢等(2004)在凡納濱對蝦的研究結(jié)果相似。肝胰腺和胃的消化酶沒有表現(xiàn)出與生長有相關(guān)性。有一些學(xué)者已經(jīng)證實，復(fù)合益生菌組有比單一益生菌組更高的蛋白酶和淀粉酶活力，本試驗的結(jié)果與上述報道不完全一致。一些研究得出甲殼動物消化酶的活性與其食性、發(fā)育階段、營養(yǎng)、溫度、pH值、鹽度等諸因素密切相關(guān)，并同時受到內(nèi)因和外因的調(diào)控。這可能的原因是低聚木糖不是芽孢桿菌的理想碳源，或者飼料中添加低聚木糖，能促進(jìn)腸道中乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量增加，當(dāng)飼料中同時添加芽孢桿菌的時候，它們通過競爭營養(yǎng)附著位點或產(chǎn)生拮抗物質(zhì)來相互抑制生長，導(dǎo)致有益菌不能分泌大量的消化酶，從而影響生長。

4 結(jié)論

飼料中添加芽孢桿菌或低聚木糖可提高凡納濱對蝦幼蝦的存活率，增強消化道特別是腸道的消化酶活力，但聯(lián)合添加芽孢桿菌和低聚木糖的作用效果不理想。

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