飼料中添加三聚氰胺對吉富羅非魚生長、免疫指標及肌肉殘留量的影響

湯菊芬 吳灶和 簡紀常 魯義善 王 蓓

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，重要的氮雜環(huán)有機化工原料，其含氮量高達66%左右。學名為三氨三嗪,又稱三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。俗稱蜜胺、蛋白精。由于目前測定食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法，只能測出含氮量而無法測出氮的來源，故含氮量遠遠高于蛋白質(zhì)的三聚氰胺被不法商人摻雜進食品或飼料中，不僅對養(yǎng)殖動物健康和養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生不利影響，對人類健康也存在著潛在威脅。有關(guān)三聚氰胺對動物的毒性研究,哺乳動物研究報道較多，三聚氰胺對魚類的毒性研究大部分為急性毒性研究報道或魚組織中三聚氰胺及其類似物的檢測方法，三聚氰胺對魚類生長、免疫功能及肌肉組織殘留等方面的系統(tǒng)研究報道還很少。本試驗以目前廣東省主要淡水養(yǎng)殖魚類——吉富羅非魚為研究對象，通過在飼料中添加不同劑量的三聚氰胺，喂養(yǎng)吉富羅非魚28 d，探討三聚氰胺對吉富羅非魚生長、免疫功能及肌肉殘留量的影響，旨在為三聚氰胺在水產(chǎn)飼料中的安全性評價提供理論依據(jù)。

1 方法與材料

1.1 三聚氰胺

試驗所用三聚氰胺為上海凌峰化學試劑公司生產(chǎn)，白色粉末狀，純度≥98.5%。

1.2 試驗飼料

參照劉海燕等[1]毒性試驗結(jié)果，將三聚氰胺分別按 0、500、2000、5000、10000 mg/kg 的比例添加于基礎(chǔ)飼料（原料組成見表1）中，混勻后，用雙螺桿制粒機擠壓成粒徑為2 mm的5種顆粒飼料，風干后放入－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料主要成分含量(%)

1.3 試驗用魚及飼養(yǎng)管理

挑選外觀正常，體質(zhì)健壯，尾均體重為 (30.14±0.22)g的吉富羅非魚作為試驗用魚。養(yǎng)殖試驗在廣東海洋大學湛江東海島高新科技園的5個水泥池內(nèi)進行，每個水泥池掛 3個網(wǎng)箱（規(guī)格：1 m×1 m×0.8 m）作為一個處理，每個處理設(shè)3個重復，每個網(wǎng)箱放養(yǎng)吉富羅非魚30尾，水泥池水深為1 m。試驗用魚先暫養(yǎng)7 d后，稱初始體重，然后平均分組。試驗組分別投喂添加三聚氰胺的飼料，對照組投喂基礎(chǔ)飼料，每天于09：00和17：00投喂飼料，日投餌量為魚體重的3%～5%。為便于觀察羅非魚的攝食情況，每個網(wǎng)箱掛一個投餌臺。投餌后半小時檢查投餌臺中的飼料，如有剩余及時清理，并調(diào)整下一次的投餌量；每周根據(jù)魚的生長狀況，相應地調(diào)節(jié)投飼量，稱終末體重前24 h停止投喂。試驗全過程不間斷充氣增氧，每天換水1次，換水量為 2/3。水溫為(33.5±1.5)℃，養(yǎng)殖試驗持續(xù)28 d。

1.4 樣品的采集和保存

每周從每個網(wǎng)箱中隨機抽取5尾吉富羅非魚，先稱重，用于計算相對增重率。然后尾靜脈采血，置于Eppendorf管中，室溫下靜置1 h，待其凝固后,置4℃冰箱過夜，5000 r/min，4℃離心10 min,收集血清，－80℃下保存?zhèn)溆茫糜谘迕庖咧笜藴y定。最后，將羅非魚體表用抹布擦干，去鱗、去鰓、去內(nèi)臟，去除魚皮，取其兩側(cè)側(cè)線上的背肌肉，5尾魚的肌肉合為一個樣品，放于無菌密封袋中，立即用液氮快速冷凍，然后轉(zhuǎn)至－20℃的冰箱中保存，用于肌肉成分測定。

1.5 指標測定

1.5.1 相對增重率測定

相對增重率(%)=[(試驗末魚體重－試驗初魚體重)/試驗初魚體重]×100。

1.5.2 血清溶菌酶（LSZ）活力測定

溶菌酶的活力測定采用試管法,按Hultmark等[2]方法進行。用0.1 mol/l的磷酸鉀鹽緩沖液將溶壁微球菌配成懸液(OD570≈0.3),取3 ml懸液于試管內(nèi)冰浴,再加入50 μl待測樣品,混勻后測其吸光度(A),然后將試管于37℃溫浴30 min后(保溫過程中要不停地振蕩),取出冰浴10 min以終止反應,測吸光度(A0)。并按下面公式計算：

溶菌酶活力UL(相對酶活)=(A0－A)/A。

1.5.3 血清超氧化物歧化酶（SOD）活力測定

SOD活力用南京建成生物工程研究所提供的測試盒測定，具體測定步驟按說明書進行。

1.5.4 血清堿性磷酸酶（AKP）活力測定

AKP活力用南京建成生物工程研究所提供的測試盒測定，具體測定步驟按說明書進行。

1.5.5 肌肉中三聚氰胺殘留量測定

用高效液相色譜法測定，參照劉永濤等[3]方法稍加修改。

①樣品處理：稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 ml離心管內(nèi)，準確加入10 ml提取液，渦旋混合均勻1 min，振蕩提取20 min，靜止2 min后，于5000 r/min的離心機上離心10 min，取上清液2 ml轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中，于8000 r/min的高速離心機離心8 min。取上清液過0.2 μm濾膜上機測定。

②色譜條件：色譜柱DIKMA C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈： 離子對試劑溶液=8+92(v/v)；流速為1.2 ml/min；檢測波長236 nm；柱溫40℃；進樣量 20 μl；流動相使用前過0.45 μm 濾膜。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS11.5分析軟件對樣本進行單因素方差分析(one－way ANOVA)和Duncan's法多重分析。大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 三聚氰胺對吉富羅非魚生長的影響(見圖1)

圖1 三聚氰胺對吉富羅非魚增重率的影響

由圖1可知，從第7 d開始,隨著三聚氰胺添加劑量的增加，試驗組吉富羅非魚的增重率呈降低趨勢。在第21 d和第28 d，10000 mg/kg組羅非魚的增重率顯著低于對照組（P＜0.05），其余三個試驗組吉富羅非魚的增重率與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 三聚氰胺對吉富羅非魚血清LSZ活力的影響(見圖2)

圖2 三聚氰胺對吉富羅非魚血清LSZ活力的影響

由圖2可知，三聚氰胺對吉富羅非魚血清中溶菌酶活力無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 三聚氰胺對吉富羅非魚血清SOD活力的影響(見圖3)

由圖3可知，三聚氰胺對吉富羅非魚血清中的SOD活力無顯著影響（P＞0.05）。

圖3 三聚氰胺對吉富羅非魚血清SOD活力的影響

2.4 三聚氰胺對吉富羅非魚血清AKP活力的影響(見圖4)

圖4 三聚氰胺對吉富羅非魚血清AKP活力的影響

由圖4可知，三聚氰胺對吉富羅非魚血清中的AKP活力的影響呈先升高后降低趨勢,在第7 d和14 d，各試驗組吉富羅非魚血清中的AKP活力較對照組有所提高，但影響不顯著（P＞0.05）；在第 21 d 和 28 d，各試驗組羅非魚血清中的AKP活力低于同期對照組，5000 mg/kg組和10000 mg/kg組顯著低于同期對照組(P＜0.05)。

2.5 三聚氰胺對吉富羅非魚肌肉組織中殘留量的影響(見圖5)

本試驗中對照組吉富羅非魚肌肉在整個試驗階段均未檢測到三聚氰胺殘留量；從第7 d開始，各試驗組吉富羅非魚肌肉中均檢測到三聚氰胺殘留。500 mg/kg組，吉富羅非魚肌肉中的三聚氰胺殘留量隨著養(yǎng)殖時間的延長而逐漸升高；2000 mg/kg組和 5000 mg/kg組在第14 d就檢測到較高的殘留量，并且與第21 d、28d檢測到的殘留水平差不多；10000mg/kg組吉富羅非魚肌肉中的三聚氰胺的殘留量在第7 d就明顯高于其他試驗組，之后隨養(yǎng)殖時間延長，三聚氰胺的殘留量略有升高。

圖5 飼料中三聚氰胺對吉富羅非魚肌肉三聚氰胺殘留的影響

3 討論

3.1 三聚氰胺對吉富羅非魚增重率的影響

目前,已有研究表明養(yǎng)殖動物長期攝食含三聚氰胺的飼料會對生長性能產(chǎn)生不良影響。張小燕等[4]（2009）在基礎(chǔ)日糧中添加不同水平的三聚氰胺，喂養(yǎng)黃羽肉雞42 d。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)日糧中添加三聚氰胺可顯著降低黃羽肉雞的平均體重(P＜0.05)。李倜等[5](2010)在肉雞飼糧中添加 0(對照組)、250、500、1000 和2000 mg/kg三聚氰胺，喂養(yǎng)肉雞42 d，結(jié)果表明，添加量為1000和2000 mg/kg時，肉雞的平均體增重有下降的趨勢。高春起等[6](2010)報道，日糧添加三聚氰胺對蛋鴨采食量和飼料轉(zhuǎn)化率無顯著影響(P＞0.05），隨著日糧三聚氰胺含量的增加，平均蛋重和產(chǎn)蛋率呈逐漸降低的趨勢。田永剛[7](2010)給小鼠灌胃四種濃度的三聚氰胺（0、1、2 和 4 mg/kg），染毒一周后，2 mg/kg濃度組小鼠體重增長顯著性下降（P＜0.05），4 mg/kg濃度組小鼠體重極顯著下降(P＜0.01)。劉海燕等[8]（2009）報道，飼料中添加三聚氰胺顯著影響了花鱸21 d的攝食與生長(P＜0.05),最高劑量組(10000 mg/kg)花鱸的攝食率顯著低于對照組(P＜0.05),而末均重和特定生長率顯著低于0、500 mg/kg及 2000 mg/kg處理組(P＜0.05)。本試驗的結(jié)果表明：從21 d開始，10000 mg/kg組吉富羅非魚的增重率顯著低于對照組(P＜0.05)，這與上述學者的研究結(jié)果一致。

3.2 三聚氰胺對吉富羅非魚血清非特異性免疫指標的影響

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺對吉富羅非魚血清中的溶菌酶活力、SOD活力無顯著影響，但對AKP活力有影響。在第7 d和第14 d，各試驗組的吉富羅非魚血清中的AKP活力呈升高趨勢，在第21 d和28 d，各試驗組血清中的AKP活力呈下降趨勢，且5000 mg/kg和10000 mg/kg組吉富羅非魚血清中的AKP活力顯著低于同期對照組（P＜0.05）。AKP是一種膜結(jié)合蛋白，在體內(nèi)直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝生理過程，與維持體內(nèi)適宜的鈣磷比例有關(guān)，并在免疫反應中發(fā)揮作用，當肝細胞受損時，血清中的AKP活性升高。血清AKP活性的降低主要由重癥慢性腎炎并伴有慢性腎衰或者營養(yǎng)不良等病癥引起[9]。研究表明,動物長期攝入過量的三聚氰胺,會對肝臟細胞和腎臟造成不同程度的損傷。Neerman等[10]（2004）給小鼠注射40 mg/kg劑量的三聚氰胺會造成肝壞死。張薇[11](2009)在SD大鼠急性試驗中研究表明，光鏡下可見少數(shù)肝細胞核出現(xiàn)固縮或沉積，局部可見炎性細胞浸潤。劉匯濤[12](2010)用含三聚氰胺、三聚氰酸及二者混合物日糧飼喂藍狐,在染毒第34、65和98 d血清堿性磷酸酶活性與對照相比差異不顯著(P＞0.05)，但存在降低趨勢,在染毒第126 d,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的血清堿性磷酸酶活性極顯著降低(P＜0.01)。說明各添加三聚氰胺和三聚氰酸組藍狐在第34 d腎臟可能已經(jīng)開始受到損傷，但直到染毒第126 d才開始顯現(xiàn)出來。此外，組織學研究表明，各添加三聚氰胺和三聚氰酸試驗組藍狐的腎臟受到了不同程度的損傷，肝臟也發(fā)生輕微病變。本試驗的研究結(jié)果與上述學者的研究結(jié)果相似，在28 d的試驗期內(nèi)，各試驗組吉富羅非魚血清中的AKP活力在前兩周呈升高趨勢，后兩周中AKP活力呈降低趨勢(5000 mg/kg和10000 mg/kg組吉富羅非魚的AKP活力顯著低于對照組)，推測中、高劑量組吉富羅非魚的肝細胞和腎臟可能在第14 d就開始有損傷，到第21 d開始顯現(xiàn)出來。

3.3 三聚氰胺對吉富羅非魚肌肉組織殘留的影響

三聚氰胺的三嗪環(huán)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，在機體內(nèi)的代謝屬于不活潑代謝或惰性代謝。Mast等[13](1983)認為動物經(jīng)口攝入三聚氰胺以后，在體內(nèi)會發(fā)生水解，生成三聚氰胺同系物，再經(jīng)過血液分布全身。Reimschuessel等[14](2008)在對斑點叉尾鮰進行三聚氰胺實驗時發(fā)現(xiàn)，每日給一條斑點叉尾鮰400 mg/kg劑量的三聚氰胺3 d，休藥1 d后其肌肉中三聚氰胺的殘留量為210 mg/kg。燕磊等[15](2009)報道，當飼糧中添加不同劑量的三聚氰胺，肉鴨組織中三聚氰胺殘留量隨日糧中三聚氰胺含量的升高而線性升高。李倜[16](2010)在肉雞飼料中添加不同劑量的三聚氰胺，飼喂23 d后，在肉雞血漿、胸肌、肝臟、腎臟都有三聚氰胺殘留，且殘留量隨著三聚氰胺添加量的增加而呈線性增加(P＜0.01)。劉海燕等[17](2010)報道，在花鱸飼料中添加不同劑量的三聚氰胺進行56 d的喂養(yǎng)實驗，花鱸的肝臟和肌肉中均檢測到了三聚氰胺的殘留，在三聚氰胺日攝入量為每千克體重148.83 mg時,肝臟三聚氰胺殘留量達到57.9 mg/kg，肌肉中三聚氰胺的殘留量在三聚氰胺日攝入量為每千克體重80.34 mg和148.83 mg時分別為47.63 mg/kg和73.17mg/kg。本試驗的研究結(jié)果與上述學者的研究結(jié)果相一致，從第7 d開始，各試驗組吉富羅非魚肌肉中均檢測到三聚氰胺殘留量。500 mg/kg劑量組吉富羅非魚肌肉中的三聚氰胺殘留量隨著養(yǎng)殖時間的延長而逐漸升高，2000 mg/kg和5000 mg/kg劑量組在第14 d檢測到較高的殘留量，10000 mg/kg劑量組吉富羅非魚肌肉中的三聚氰胺的殘留量在第7 d就明顯高于其他試驗組。說明三聚氰胺在吉富羅非魚肌肉中的殘留量呈劑量依賴性，低劑量組還與投喂時間成正相關(guān)關(guān)系。

[1]劉海燕,張偉,薛敏,等.三聚氰胺對吉富羅非魚的急性毒性研究[J].河北師范大學學報(自然科學版),2009,33(5):559-665.

[2]Hultmark D.Insect immunity:Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophera cecropia[J].Eur J Biochem.,1980,106:7-16.

[3]劉永濤,楊紅,艾曉輝.高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中三聚氰胺的殘留量[J].分析實驗室,2009,28:138-141.

[4]張小燕，施祖灝，陸俊賢,等.三聚氰胺對黃羽肉雞生長性能和血液生化指標的影響[J].中國家畜,2009,31(21):25-28.

[5]李倜,丁雪梅,張克英,等.飼糧中添加三聚氰胺對肉雞生長性能和健康的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2010,22(6):1694-1702.

[6]高春起,武書庚,齊廣海,等.三聚氰胺對蛋鴨產(chǎn)蛋性能、血清指標和肝腎組織結(jié)構(gòu)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2010,43(5):1050-1056.

[7]田永剛.食品中低劑量三聚氰胺對雄性小鼠生長及生殖的影響[D].蘇州大學碩士學位論文,2010.

[8]劉海燕，張偉，薛敏,等.三聚氰胺對花鱸的急性毒性研究[J].水生生物學報,2009,33(2):157-163.

[9]朱一堂,李福坤,孫艷,等.成年男性血清堿性磷酸酶活力降低的主要臨床意義[J].河北北方學院學報(醫(yī)學版)，2006，23(4)：59-60.

[10]Neerman M F,Zhang Wen,Parrish A R,et al.In vitro and in vivo evaluation of a melamine dendrimer as a vehicle for drug delivery[J].International Journal of Pharmaceutics,2004,28(1):129-132.

[11]張薇.三聚氰胺尿結(jié)石模型及中藥三金湯干預作用研究[D].廣西中醫(yī)藥大學碩士學位論文，2009.

[12]劉匯濤.三聚氰胺對藍弧生產(chǎn)性能、血清指標及肝腎組織結(jié)構(gòu)的影響[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文,2010.

[13]Mast R W,Jefcoat A R,Sadler B M,et al.Metabolism,Disposition and Excretion of Melamine in Male Fisher 344 Rats[J].Food and Chemical Toxicology,1983,21(6):807-810.

[14]Reimschuessel R,Gieseker C M,Miller R A,et al.Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melamine and cyanuric acid to fish and pigs[J].American Journal Veterinary Research,2008,69:1217-1228.

[15]燕磊,郭吉原,孫作為,等.飼喂不同含量三聚氰胺日糧后肉鴨組織中三聚氰胺的殘留量分析[J].中國家禽,2009,31(13):16-19.

[16]李倜.三聚氰胺對肉雞生產(chǎn)性能、健康的影響和組織殘留、消除規(guī)律的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2010.

[17]劉海燕，張偉，薛敏,等.飼料中三聚氰胺對花鱸生長、生理機能及組織殘留的影響[J].水生生物學報,2010,34(6):1097-1105.