針刺對胃腸平滑肌收縮粗肌絲調節(jié)機制的影響

鄧晶晶,袁青

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針刺對胃腸平滑肌收縮粗肌絲調節(jié)機制的影響

鄧晶晶1,袁青2

(1.廣州市第八人民醫(yī)院中西醫(yī)科,廣州 510060;2.廣州中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,廣州 510405)

觀察針刺對胃腸平滑肌收縮粗肌絲調節(jié)機制的影響,并分析此影響與針刺調整胃腸動力的關系。將30只SD大鼠隨機分為空白組、模型組(行結腸吻合術)和針刺組,每組10只。針刺組予每日針刺雙側足三針(足三里、三陰交、太沖),連續(xù)3 d。觀察各組大鼠小腸推進率、核掃描胃液相排空實驗,取結腸組織檢測鈣調蛋白mRNA表達、肌球蛋白輕鏈激酶表達、平滑肌肌動蛋白表達的變化。針刺組小腸推進率、胃半排時間和排空率較模型組有所改善(＜0.01,＜0.05)。各組鈣調蛋白mRNA表達未見顯著性差異。結腸平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶表達和平滑肌肌動蛋白表達空白組最高,模型組明顯下降,而針刺組較模型組有所上升(＜0.05)。針刺促進術后胃腸動力的恢復可能與提高平滑肌收縮粗肌絲調節(jié)機制中的平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶表達和平滑肌肌動蛋白表達有關,與鈣調蛋白mRNA表達無關。

針刺;鈣調蛋白;大鼠;肌球蛋白輕鏈激酶

平滑肌收縮裝置是一個收縮蛋白質體系,依其功能分為收縮蛋白質(肌球蛋白、肌動蛋白)、調節(jié)蛋白質(鈣調蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶、肌球蛋白輕鏈磷酸酶、原肌球蛋白)和細胞骨架蛋白質(結蛋白、波形蛋白)?，F(xiàn)今公認的調節(jié)平滑肌收縮的經(jīng)典機制為粗肌絲相關調節(jié)機制,又稱為Ca2＋-鈣調蛋白-肌球蛋白輕鏈激酶依賴的機制[1]。主要機制為在Ca2＋的參與下,肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)催化肌球蛋白輕鏈(20kD myosin light chains,MLC20)磷酸化,磷酸化的肌球蛋白分解足夠的ATP,通過與肌動蛋白的相互作用而產(chǎn)生收縮。

腹部術后由于受到手術麻醉創(chuàng)傷,術后禁食鎮(zhèn)痛、腹腔內(nèi)積血或引流管的機械刺激等綜合因素的作用,胃腸平滑肌的收縮功能常常出現(xiàn)紊亂,表現(xiàn)為術后腹脹腹痛,惡心嘔吐,排氣排便困難或腹瀉等胃腸運動功能障礙的一系列癥狀。針刺用于促進術后胃腸運動功能的恢復在臨床上已經(jīng)取得一定成效[2-4],但其作用機理尚未明確。本研究從調節(jié)平滑肌收縮的粗肌絲相關機制著手,探討針刺對其影響,分析此影響與針刺調整胃腸動力的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

99mTc-DTPA(北京原子高科公司提供,放化純＞95%);Rabbit anti-MLCK(北京博奧森生物技術有限公司提供),anti-SMA和即用型SABC兔IgG免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供);Trizol和RNA提取液、MMLV、Taq酶、dNTPs(達安生物工程有限公司提供);3900臺式高通量DNA合成儀、9700 PCR儀、7500全自動熒光定量PCR儀(美國ABI公司提供);HC-3018R高速冷凍離心機(安徽科大創(chuàng)新公司提供);－80℃冰箱(日本Sanyo公司提供);Varicam型雙探頭可變角度單光子發(fā)射型計算機斷層顯像儀(SPECT),配平行孔低能高分辨型準直器(以色列Elscimt公司提供);2135病理切片機(德國Leika公司提供);光學顯微鏡(日本Olympus公司提供)。

1.2 動物分組及模型制備

SPF級健康SD大鼠30只,雌雄各半,體重250～300 g,由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(0055935)。按完全隨機法將其分為針刺組、模型組、空白組,每組10只。

腸腸吻合模型制備具體操作為,術前禁食禁飲12 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量為0.33 mL/ 100 g)。仰臥位固定,常規(guī)備皮、消毒,下腹正中切口,長約2 cm;尋找到大鼠盲腸下2 cm處結腸,切斷后行原位縫合(一層縫合法);關腹。手術當天禁食禁飲水,術后第1、2天流質飲食,第3天核掃描后予標準鼠料,控制食量,按l6～20 g/(只·d)的1/3量供給,術后第4天處死檢測指標。

1.3 穴位定位與針刺方法

取足三針,即雙側足三里、三陰交、太沖,定位參考《實驗針灸學》。針刺組動物術后清醒即予針刺,采用0.18 mm×10 mm毫針直刺入穴位,每5 min緩慢提插捻轉2～3次,每日針刺1次,每次15 min。模型組、空白組每天同一時間放于固定器中15 min。療程為3 d。

1.4 核素掃描胃液相排空試驗

術后第3天檢查前將大鼠禁食12 h,用安定4 mg/ kg行腹腔注射。予液體試驗餐灌胃(液體試驗餐由99mTc-DTPA和0.9%NS混合配制,灌胃劑量為1.5 mL試驗餐/只,內(nèi)含0.1～0.2 mCi99mTc-DTPA)。將大鼠置入圓筒固定器,采用大鼠立位將圓筒固定器放置于檢測床上,調整低能通用型準直器的探頭視野中心置于大鼠腹部,動態(tài)連續(xù)采集,能峰160 keV,窗寬20,矩陣256×256,Zoom(放大倍數(shù))1.0,采集時間20 s/幀,共60 min。用計算機軟件(GASTRICEMPTYING)處理后獲得胃排空-時間曲線,通過曲線找出相對應的胃半排時間(GET1/2),并計算胃60 min排空率。胃排空率=(總放射性-t時胃內(nèi)放射性K)/總放射性×100%。K為從時間0至t時的放射性衰變校正系數(shù)(此過程計算機自動處理)。

1.5 小腸推進率的測定

碳素墨水予大鼠灌胃1 mL/只,30 min后處死,用米尺測量小腸全長(幽門至回盲部)以及標記物在小腸從幽門向前推進的距離(從幽門至炭末前沿的長度)。計算標記物推進的距離占小腸全長的百分比。

1.6 鈣調蛋白(calmodulin,CaM)mRNA的測定

取盲腸下2 cm處結腸(相當吻合口處)組織100 mg,充分研磨,TRIzol(Gibco BRL,USA)一步法提取組織總RNA。取RNA模板逆轉錄合成cDNA,37℃1 h,然后95℃逆轉錄反應滅活3 min。取逆轉錄產(chǎn)物加入PCR擴增反應體系中,93℃3 min,然后93℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,共40循環(huán)。CaM1(擴增片段長度102 bp)的引物序列:5’-GACTGTCATGCGGTCACTGG-3’(上游), Reverse Primer為5’-TCTGGGAAGTCAATGGTGCC-3’ (下游)。內(nèi)參基因R-GAPDH(擴增片段長度134 bp)的引物序列為5’-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3’(上游),5’-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3’(下游)。由電腦自動分析并計算結果(拷貝數(shù)/mL cDNA)?？紤]到各個樣本總RNA濃度的差異,按下列公式換算,A=B1(目的基因)/B2(內(nèi)參基因)。

1.7 肌球蛋白輕鏈激酶和平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin,SMA)表達的測定

①取盲腸下2 cm處結腸(相當吻合口處),去除內(nèi)容物,PBS漂洗,于10%福爾馬林中固定。②包埋,切片,脫蠟,梯度乙醇水化,加3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶,用檸檬酸行抗原修復,滴加5%BSA封閉液室溫20 min,加一抗恒溫箱1 h,PBS漂洗后加二抗室溫20 min,PBS漂洗后加SABC液室溫20 min,PBS漂洗后DAB顯色,蘇木素復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片,閱片,照相。③相對表達量分析。對肌球蛋白輕鏈激酶表達采用分級判斷方法,(－)為無染色信號;(＋)為染色信號呈細顆粒狀,色棕黃,陽性細胞占總細胞數(shù)＜50%;(＋＋)為染色信號呈細顆粒狀,色棕黃,陽性細胞占總細胞數(shù)＞50%;(＋＋＋)為染色信號呈粗顆粒狀或塊狀,色棕黑,陽性細胞占總細胞數(shù)＜50%;(＋＋＋＋)為染色信號呈粗顆粒狀或塊狀,色棕黑,陽性細胞占總細胞數(shù)＞50%。對平滑肌肌動蛋白表達使用EIG綜合圖像分析軟件處理,用亮度值表示染色深淺,范圍值由0(深)～255 (淺)。每張切片均隨機選取3個視野,計算其平均亮度值。

1.8 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用檢驗,計數(shù)資料比較用卡方檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組胃半排時間與60 min排空率比較

由表1可見,模型組胃半排時間、60 min排空率與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。針刺組胃半排時間、60 min排空率與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01),提示針刺能促進胃排空加快。針刺組胃半排時間、60 min排空率與空白組比較,差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05),提示術后3 d,在針刺作用下胃排空功能基本恢復正常。

表1 三組胃半排時間與60 min排空率比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01;與空白組比較2)＜0.05

2.2 小腸推進率

由表2可見,模型組小腸推進率與針刺組和空白組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。針刺組小腸推進率與空白組比較,差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05),表明針刺治療能提高小腸推進率。

表2 三組小腸推進率比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.05;與空白組比較2)＜0.05

2.3 三組鈣調蛋白mRNA含量比較

針刺組、模型組和空白組胃腸組織CaM1 mRNA含量分別為(0.055±0.03)、(0.034±0.04)和(0.034±0.03),組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05),提示針刺調整術后胃腸平滑肌收縮粗肌絲調節(jié)可能不是主要通過改變胃腸組織的CaM1 mRNA含量而實現(xiàn)。

2.4 三組肌球蛋白輕鏈激酶的表達

空白組結腸平滑肌MLCK表達陽性顆粒數(shù)量較多,色棕黃,達到(＋＋),模型組陽性顆粒數(shù)量明顯減少,染色較淺,密度降低,分布稀疏,甚至消失,為(－～＋),而針刺組陽性顆粒較模型組在數(shù)量、密度和染色程度方面均有所上升,為(＋＋)。詳見圖1。

圖1 結腸組織MLCK表達的免疫組化染色(SABC-DAB法,×200)

2.5 三組平滑肌肌動蛋白的表達

空白組結腸組織肌動蛋白表達陽性顆粒呈粗顆粒狀,深棕色,數(shù)量較多,灰度值為(90.33±0.18);模型組為陽性顆粒顯著減少甚至消失,灰度值為(192.11±0.23);針刺組陽性顆粒數(shù)量較模型組有所增加,分布較為稀疏,著色程度不如空白組,灰度值為(125.06±0.12)。與空白組比較,模型組結腸組織肌動蛋白含量術后明顯下降(檢驗,＜0.05),而針刺組較模型組有所上升(檢驗,＜0.05)。詳見圖2。

圖2 結腸組織SMA免疫組化染色(SABC-DAB法,×200)

3 討論

Ca2＋是細胞信號轉導系統(tǒng)中重要的第二信使物質,Ca2＋濃度的變化引起鈣調蛋白(CaM)構象和活性的變化,進一步激活含CaM結合位點的靶蛋白——Ca2＋/CaM依賴性蛋白激酶(Ca2＋/calmodulin dependent protein kinases,CaM Ks)和Ca2＋/CaM依賴性蛋白磷酸酶。CaMKs屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族,肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)為其中一員。磷酸化酶激酶使磷酸化酶發(fā)生磷酸化,從而調節(jié)體內(nèi)物質代謝。

肌球蛋白磷酸化學說認為[5-9],肌肉處于靜息態(tài)時,細胞內(nèi)游離鈣濃度為0.2mmol/L,肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)分子折疊,催化域與“偽底物域”結合,呈非活性酶,肌球蛋白20kD輕鏈(MLC20)不能發(fā)生磷酸化,肌球蛋白與肌動蛋白無反應。當肌肉接受刺激發(fā)生興奮時,胞外鈣離子內(nèi)流和肌漿網(wǎng)鈣離子釋放,細胞內(nèi)游離鈣濃度上升為0.6mmol/L,Ca2＋即與CaM結合進而結合于MLCK成為三元體,使MLCK發(fā)生構象變化而活化呈活性酶,催化MLC20的19位絲氨酸磷酸化,增加了肌球蛋白頭部的ATP酶活性,導致Mg2＋-ATP分解,由此產(chǎn)生的磷酸基結合于橫橋使其處于高自由能狀態(tài),啟動橫橋循環(huán),粗、細肌絲相互滑動,肌肉收縮。

粗肌絲是組成肌節(jié)的肌球蛋白絲,而肌動蛋白絲則是構成細肌絲的核心。肌動蛋白絲又稱纖維狀肌動蛋白,為ATP驅動的肌球蛋白提供運動軌道,傳遞張力,在細胞收縮、運動中起重要作用。故平滑肌肌動蛋白含量對平滑肌的收縮能力具有較大影響[10]。

本研究對胃腸平滑肌收縮粗肌絲調節(jié)機制的重要分子如鈣調蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶和肌動蛋白進行了測定。結果提示,鈣調蛋白mRNA在空白組、模型組和針刺組間沒有明顯改變。而平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)表達和平滑肌肌動蛋白(SMA)表達在結腸術后均有所下降(模型組與空白組比較,＜0.05),針刺能提高其表達(針刺組與模型組比較,＜0.05)。且MLCK和SMA表達增多的針刺組其小腸推進率和核素掃描胃排空實驗的結果均好于模型組(＜0.05,＜0.01),與空白組無顯著性差異(＞0.05)。故由此可以推斷,針刺促進術后胃腸動力的恢復可能與其提高結腸平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶表達和平滑肌肌動蛋白表達有關,與鈣調蛋白mRNA表達無關。

[1] 陳明,李愛媛.肌肉肌球蛋白,粗肌絲和Ca2＋調節(jié)機制的多樣性[J].生理科學進展,1993,24(1):6-9.

[2] 宋建喬.針刺促進腹部手術后胃腸功能恢復的臨床觀察[J].河北中醫(yī),2009,31(2):288,292.

[3] 周艷玲,張金成,黃錦萍.穴位低頻電刺激與穴位針刺對腸梗阻手術后胃腸蠕動功能影響的比較[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2010,19 (18):2269,2274.

[4] 陳捷,孫立明,馬尚偉.針刺治療膽囊結石術后胃腸功能紊亂臨床觀察[J].上海針灸雜志,2010,29(5):298-299.

[5] De Lanerolle P, Paul RJ. Myosin phosphorylation dephosphorylation and regulation of airway smooth muscle contractility[J]. Am J Physiol, 1991,261(2pt1):1-14.

[6] 陳明,李愛媛.平滑肌肌球蛋白B的超沉淀與調節(jié)輕鏈磷酸化[J].生物化學雜志,1992,8(4):424-428.

[7] Kamm KE, Stull JT. Myosin phosphorylation,force,and maximal shortening velocity in neurally stimulated tracheal smooth muscle[J]. Am J Physiol, 1985,249(3pt1):238-247.

[8] Kamm KE, Stull JT. The function of myosin and myosin light chain kinase phosphorylation in smooth muscle[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1985,25:593-620.

[9] Vale RD, Milligan RA. The way things move: looking under the hood of molecular motor proteins[J]. Science, 2000,288(5463):88-95.

[10] Halayko AJ, Salari H, MA X,. Marker of airway smooth muscle cell phenotype[J]. Am J Physiol, 1996,270(6Pt1):1040-1051.

Effect of Acupuncture on the Mechanism of Regulation of Thick Filaments During Gastrointestinal Smooth Muscle Contraction

-1,2.

1.,8’,510060,; 2.-,510405,

To investigate the effect of acupuncture on the mechanism of regulation of thick filaments during gastrointestinal smooth muscle contraction and analyze the relationship between the effect and acupuncture regulation of gastrointestinal motility.Thirty SD rats were randomly allocated to blank, model (colonic anastomosis was performed) and acupuncture groups, 10 rats each. In the acupuncture group, bilateral three leg points (Zusanli, Sanyinjiao and Taichong) were needled every day for three consecutive days. The intestinal propulsion rate was examinedand nuclear liquid phase gastric emptying scanwas taken in each group of rats. The colonic tissue was taken to examine the expressions of calmodulin mRNA, myosin light chain kinase and smooth muscle actin.The intestinal propulsion rate, and the gastric emptying half timeand emptying rate improved somewhat in the acupuncture group compared with the model group. There was no significant difference in the expression of calmodulin mRNA between the groups. The expressions of myosin light chain kinase and actin of colonic smooth muscles were highest in the blank group, decreased markedly in the model group and increased somewhat in the acupuncture group compared with the model group.That acupuncture promotes the postoperative recovery of gastrointestinal motility may be related to the expressions of smooth muscle myosin light chain kinase and actinin improving the mechanism of regulation of thick filaments during smooth muscle contraction and not related to the expression of calmodulin mRNA.

Acupuncture; Calmodulin; Rat; Myosin light chain kinase

1005-0957(2011)11-0783-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.11.783

2011-02-23

鄧晶晶(1982 - ),女,醫(yī)師,博士