生物添加劑對水葫蘆與甜玉米秸稈混合青貯品質(zhì)的影響

陳鑫珠，莊益芬，張建國，廖惠珍，張文昌，張兆陽，陳慶達(dá)

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002）

水葫蘆（Eichhorniacrassipes），別名鳳眼蓮、洋水仙等，是單子葉植物，為雨久花科、鳳眼蓮屬多年生漂浮性水生草本植物。1901年作為花卉引入我國，由于水葫蘆無性與有性繁殖力均強(qiáng)，喜群生，往往形成單一的優(yōu)勢群落，從而導(dǎo)致了以水葫蘆為主體的有害水草的“瘋長”，堵塞了河道，對社會、經(jīng)濟(jì)也產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響，現(xiàn)被“世界自然保護(hù)聯(lián)盟”列為世界百名“生物殺手榜”的亞軍和世界公認(rèn)的十大害草之冠。由此，控制水葫蘆蔓延倍受重視。

目前水葫蘆的轉(zhuǎn)化利用方式主要有3種：第1種，用作能源；第2種，用作食用菌類的培養(yǎng)原料；第3種，作為高產(chǎn)的青綠飼料。Gajalakshmi等［1］研究表明，利用水葫蘆的堆肥和蠕蟲蠕動堆肥生產(chǎn)的綠肥，對某些植物的生長有明顯的促進(jìn)效果，而且安全可行。楊宣華等［2］利用35%水葫蘆代替常規(guī)培養(yǎng)料中棉籽殼栽培平菇，生物學(xué)效率達(dá)161%，獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益。我國曾開展利用水葫蘆栽培平菇、金針菇、草菇等多種食用菌［3］。利用經(jīng)過發(fā)酵處理后的水葫蘆進(jìn)行喂養(yǎng)魚試驗，也取得了良好的效果［4］。

水葫蘆的營養(yǎng)豐富，素來有“經(jīng)典飼料”之稱，其鮮草的營養(yǎng)成分為粗蛋白1.2%，粗脂肪0.2%，粗纖維1.1%，無氮浸出物2.3%，粗灰分1.3%［5］。以單位面積產(chǎn)量計算，水葫蘆生產(chǎn)的蛋白質(zhì)比大豆還高6～10倍，將水葫蘆加工后摻入牛飼料中，其所含的蛋白質(zhì)和無機(jī)成分可與棉籽粉和大豆粉相媲美，是營養(yǎng)豐富而全面的優(yōu)質(zhì)飼料。水葫蘆為水生植物，含有較高的水分，最高可達(dá)到98%以上，打撈后易變質(zhì)，必須采用有效的方法處理后才能長期保存和利用。隨著青貯飼料技術(shù)的研究和推廣，調(diào)制水葫蘆青貯不失為一種技術(shù)上可行、經(jīng)濟(jì)上合理的飼料化利用的有效途徑。采用青貯發(fā)酵的方法不僅可使水葫蘆長期保存和利用，又可保持水葫蘆原有的多汁、適口以及青貯飼料的諸多優(yōu)良特性。目前，有關(guān)水葫蘆青貯的研究較少，技術(shù)方法還有待于進(jìn)一步提高。因此，借鑒國外的一些先進(jìn)技術(shù)，研究探索有效利用水葫蘆的方法對于我國青貯飼料的多元化發(fā)展，緩解目前常規(guī)飼料資源緊缺具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 青貯原料

青貯原料為水葫蘆和甜玉米（Zeamaysvar.rugosa）秸稈，水葫蘆是福建農(nóng)林大學(xué)校園湖水中生長的，玉米秸稈是福建農(nóng)林大學(xué)作物學(xué)院實驗基地種植的世珍甜玉米秸稈，2種原料均于2009年6月29日人工刈割，晾曬24h后調(diào)制青貯。

1.2 添加劑

添加劑為綠汁發(fā)酵液（fermented green juice，F(xiàn)GJ）、纖維素酶（cellulase，CEL）、綠汁發(fā)酵液＋纖維素酶（MIX）3種。

FGJ參照文獻(xiàn)［6］的方法制成。CEL為廣東溢多利公司提供純度為98%的纖維素酶，酶活為10萬U／g。將其配制成2.5%水溶液備用。

1.3 試驗設(shè)計

設(shè)4×4的兩因子試驗。即4種混合比例和4個添加劑處理。4種混合比例青貯按水葫蘆∶玉米秸稈晾曬后的鮮重比為8∶2，7∶3，6∶4，5∶5分別進(jìn)行調(diào)制（分別用 W8M2、W7M3、W6M4、W5M5表示）。4個添加劑處理是無添加（CK）、添加2mL／kg綠汁發(fā)酵液（FGJ）、添加2mL／kg纖維素酶（CEL）和添加2mL／kg綠汁發(fā)酵液＋2mL／kg纖維素酶（MIX）。每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.4 青貯調(diào)制

2009年6月30日進(jìn)行青貯調(diào)制。2種原料切短成1～2cm長、分別混合均勻，將2種原料按試驗設(shè)計比例分別稱重，將2種原料混合均勻后，按每個重復(fù)所需重量（預(yù)試驗測得）分別稱重裝入貼有標(biāo)簽的塑料袋內(nèi)，加入添加劑和蒸餾水（所加液體體積相等），混勻后裝入1L專用青貯試驗塑料瓶內(nèi)，填裝、壓實、密封。常溫條件下貯存60d開封，供分析測定。

1.5 測定項目與方法

原料和青貯飼料的分析樣本是通過在65℃、48h烘干測初水分；按常規(guī)方法［7］測定水分和粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）含量；中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量用 Van Soent等［8］的方法測定；水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）用比色法［9］測定。取具代表性青貯樣品100g裝入有刻度的500mL的廣口錐形瓶中，加入蒸餾水定容至500mL，放置4℃冰箱中，18h后用濾紙過濾，制備青貯浸提液，用pH計測定浸提液的pH值［10］；用島津LC－20AT型高效液相色譜分析浸提液的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。色譜柱：Shodex Rspak KC－811S－DVB gel Column 300×8mm；檢測器：SPDM10AVp；流動相：3mmol／L 高氯酸［11］；采用苯酚－次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮含量［12］；半纖維素（hemi－cellulose，HC）和干物質(zhì)回收率（dry matter recovery，DMR）由計算得出，計算公式如下：

DMR（%）＝［（開封時回收青貯料重×青貯料干物率）／（裝填時裝入原料重×原料干物率）］×100

1.6 青貯質(zhì)量感官評定方法

青貯料開封后參考德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（DIG）青貯質(zhì)量感官評分標(biāo)準(zhǔn)［13］進(jìn)行感官質(zhì)量鑒定。根據(jù)青貯料的氣味、結(jié)構(gòu)和色澤評定青貯料的優(yōu)劣。

1.7 統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003統(tǒng)計軟件初步處理后，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行兩因素和單因素方差分析和多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的化學(xué)成分

水葫蘆的水分、CP、NDF、ADF和HC均高于甜玉米秸稈（表1）。甜玉米秸稈的WSC是水葫蘆的8.3倍。

2.2 青貯質(zhì)量感官評定

青貯開封后進(jìn)行感官評定。各組青貯料的莖葉結(jié)構(gòu)基本保存完好，均未見發(fā)霉現(xiàn)象；顏色與原料原色相近；酸香味；質(zhì)地松軟，表明此次青貯達(dá)到良好、較為一致的厭氧條件。從各添加劑處理來看，每種混合比例青貯中，在色澤方面，CK組的顏色與原料原色相比，稍微偏黃，其他3個添加劑處理組的顏色和原料原色較相近；在氣味方面，CK組的酸味較淡，CEL組的酸味較濃，稍有不舒適感，F(xiàn)GJ組和MIX組酸味較舒適；在質(zhì)地方面，CK組稍有粘手感覺，其他3個添加劑組手感蓬松。從混合比例來看，隨著混合青貯中玉米秸稈比例的升高，青貯的顏色、氣味、質(zhì)地更好。

表1 水葫蘆和甜玉米秸稈的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of water hyacinth and maize straw

2.3 青貯的化學(xué)成分

混合比例和添加劑對5個項目均有顯著或極顯著（P＜0.05，P＜0.01）影響，且混合比例和添加劑之間在WSC、NDF、ADF和 HC這4個項目上有顯著或極顯著（P＜0.05，P＜0.01）的交互作用（表2）。

表2 混合比例和添加劑對青貯化學(xué)成分的影響Table 2 Effects of mixed ratios and additives on chemical composition of silages

同添加劑處理中不同混合比例之間相互比較，CK、FGJ、CEL以及MIX處理呈大致相同的變化趨勢，隨玉米秸稈比例的增多，水分下降，WSC增加，NDF和ADF減少。特別是這4個添加劑處理中W5M5的WSC和ADF分別顯著高于和顯著低于其他3種混合比例（P＜0.05）。此外，CK處理中，W7M3的WSC顯著（P＜0.05）高于W8M2；W6M4的水分顯著低于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的 HC顯著高于 W6M4（P＜0.05）。FGJ處理中，W7M3的水分顯著低于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的水分顯著低于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的NDF顯著低于W6M4，HC顯著高于W6M4（P＜0.05）。CEL處理中，W7M3的水分顯著低于 W8M2，WSC顯著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4水分和 HC顯著低于 W7M3，ADF顯著高于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的NDF顯著低于W6M4（P＜0.05）。MIX處理中，W7M3的水分和 ADF顯著低于 W8M2、HC顯著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的水分以及NDF和HC顯著低于W7M3、WSC顯著高于 W7M3（P＜0.05）。

同混合比例中不同添加劑處理之間相互比較，4種混合比例中，均以CK處理的WSC最低、NDF和HC最高。并且，在NDF和HC上，CK處理與其他3個添加劑處理間有顯著差異（W7M3中CEL處理的HC除外，P＜0.05）。此外，W8M2中，MIX處理的 WSC顯著高于CK（P＜0.05）；W6M4中，MIX處理的水分顯著低于CK、WSC顯著高于CK（P＜0.05）；W5M5中，3個添加劑處理的 WSC均顯著高于CK、FGJ處理的水分顯著低于CK（P＜0.05）。特別是，在 W8M2中，MIX處理的WSC顯著高于FGJ和CEL處理、NDF和HC顯著低于FGJ和CEL處理（P＜0.05）；在 W6M4中，MIX處理的NDF顯著低于FGJ和CEL處理（P＜0.05）；在 W5M5中，MIX處理的WSC顯著高于FGJ和CEL處理（P＜0.05）。

可見，4種添加劑處理的化學(xué)品質(zhì)隨玉米秸稈比例的增加有所提高；在4種混合比例青貯中，3種添加劑均顯著改善了青貯的化學(xué)品質(zhì)，在W8M2和W5M5中MIX的添加效果優(yōu)于FGJ及CEL。

2.4 青貯的發(fā)酵品質(zhì)

混合比例和添加劑對pH、LA、DMR和NH3－N有顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）影響（表3），混合比例和添加劑之間有顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）的交互作用。另外，混合比例對BA有極顯著（P＜0.01）的影響。

表3 混合比例和添加劑對青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 3 Effects of mixed ratio and additives on fermentation quality of silages

同添加劑處理中不同混合比例之間相互比較，CK、FGJ、CEL以及MIX處理中，均以W8M2的pH、BA和NH3－N最高，LA和DMR最低。特別是，W8M2的pH均遠(yuǎn)超過4.2，且BA的生成量較多。然而，隨混合青貯中玉米秸稈比例的增多，pH顯著下降（MIX處理中 W5M5除外，P＜0.05），在 W7M3、W6M4和 W5M5中未檢測到或檢測到微量的BA，并與W8M2之間均有顯著差異（P＜0.05）。此外，CK處理中，W7M3的LA顯著高于W8M2，AA和PA顯著低于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的LA和 DMR顯著高于 W7M3，NH3－N顯著低于W7M3（P＜0.05）；W5M5的 NH3－N 顯著低于 W6M4（P＜0.05）。FGJ處理中，W7M3的 DMR顯著高于W8M2，NH3－N顯著低于 W8M2（P＜0.05）；W5M5的LA和DMR顯著高于 W6M4，NH3－N顯著低于 W6M4（P＜0.05）。CEL處理中，W7M3的DMR顯著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的LA顯著高于 W7M3（P＜0.05）；W5M5的LA顯著高于 W6M4，NH3－N顯著低于 W6M4（P＜0.05）。MIX處理中，W7M3的LA和DMR顯著高于 W8M2（P＜0.05）；W6M4的NH3－N顯著低于 W7M3（P＜0.05）；W6M4和 W5M5在所有指標(biāo)上均無顯著差異。

同混合比例中不同添加劑處理之間相互比較，4種混合比例中，均以CK處理的pH和NH3－N最高、DMR最低。并且，CK處理與其他3個添加劑處理間差異顯著（W5M5的NH3－N除外，P＜0.05）。此外，W8M2中，其他3個添加劑處理的LA均顯著高于CK，F(xiàn)GJ和MIX處理的AA和BA顯著低于CK，F(xiàn)GJ處理的PA顯著低于CK（P＜0.05）；W7M3中，MIX處理的LA顯著高于CK，CEL處理的PA顯著高于CK（P＜0.05）；W5M5中，F(xiàn)GJ和CEL處理的LA顯著高于CK（P＜0.05）。在W8M2、W7M3以及 W6M4中，MIX處理的pH均低于FGJ和CEL處理（P＜0.05），在 W6M4中，MIX處理的NH3－N也低于FGJ及CEL處理（P＜0.05）。

可見，W8M2中所有青貯的發(fā)酵品質(zhì)不良；4種添加劑處理的發(fā)酵品質(zhì)隨玉米秸稈比例的增加而提高，但MIX處理中，玉米秸稈的比例達(dá)到40%以后，再增加玉米秸稈已無效；在4種混合比例青貯中，3種添加劑均有顯著的添加效果，在W8M2、W7M3以及W6M4中，MIX的添加效果優(yōu)于FGJ及CEL。

3 討論

3.1 混合比例對青貯品質(zhì)的影響

莊益芬等［14］調(diào)查了綠汁發(fā)酵液和纖維素酶對2種不同含水率（高：70.58%，低：39.62%）的水葫蘆青貯品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青貯料的pH均在4.2以上，且70.58%含水率的青貯料pH值低于39.62%含水率的青貯料，原因可能是水葫蘆的碳水化合物不足，同時，水分過低抑制乳酸菌的活動。本試驗利用甜玉米秸稈與水葫蘆混合，旨在提高原料的可溶性碳水化合物含量。W8M2中4種添加處理的pH值均較高（4.90～5.56），且產(chǎn)生較多BA，認(rèn)為這是原料 WSC（5.63%）不足所致。隨著玉米秸稈比例的升高，混合原料的 WSC分別達(dá)到7.30%，8.97%和10.64%，青貯料的pH顯著下降（MIX處理中W5M5除外），在 W7M3、W6M4和W5M5中未檢測到或只檢測到微量的BA，青貯品質(zhì)顯著提高。這與其他一些研究結(jié)果相似［15－18］，張英俊等［19］研究葛藤（Pueraria lobata）玉米混合青貯結(jié)果表明，混合青貯和玉米單貯pH值分別為3.76和3.66，葛藤單貯為4.6。葛藤一般不能用常規(guī)方法單獨青貯，原因是葛藤含糖量低，不能保證青貯過程中乳酸菌發(fā)酵占絕對優(yōu)勢。田晉梅和謝海軍［20］研究不同比例披堿草（Elymusdahuricus）和苜蓿（Medicagosativa）混合青貯，證實披堿草和苜蓿7∶3比例混合，pH值比其他比例混合青貯料低，揮發(fā)性堿基氮的含量也比其他組低。王昆昆等［21］也獲得相似結(jié)果。pH值是反映青貯品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，pH值低，證明乳酸菌在發(fā)酵過程中占主導(dǎo)，產(chǎn)生有機(jī)酸的含量高，有效抑制不良微生物的發(fā)酵，青貯發(fā)酵品質(zhì)較好。本試驗4個添加劑處理中，W6M4和 W5M5的pH均下降至4.2以下，特別是W5M5的pH、NH3－N和NDF最低，WSC最高。說明在水葫蘆玉米秸稈混合青貯中，玉米秸稈的比例越高，越有利于青貯的乳酸發(fā)酵。

3.2 添加劑對青貯品質(zhì)的影響

綠汁發(fā)酵液是新型的青貯添加劑，其由純自然微生物群落組成，作為青貯的生物添加劑是一項新的嘗試，最初由日本開始研究。其取材方便，制作簡單，能夠有效改善青貯的發(fā)酵品質(zhì)，目前被認(rèn)為是最好的天然生物添加劑［22－24］。本試驗添加FGJ使4種混合比例青貯料的pH、NDF和HC顯著降低，DMR顯著提高，并使 W8M2和W5M5的LA顯著增加，W5M5除外的青貯料的NH3－N顯著降低。這與馬春暉等［25］的研究結(jié)果相似。Shao等［26］在燕麥（Avenasativa）中分別添加葡萄糖、山梨酸及綠汁發(fā)酵液調(diào)制青貯，對比發(fā)現(xiàn)，添加綠汁發(fā)酵液可獲得最低的pH值，最高的乳酸含量以及較高的WSC殘留量。Bureenok等［27］在大黍（Panicummaximum）青貯中添加綠汁發(fā)酵液后，pH值及氨態(tài)氮含量顯著降低，乳酸含量顯著升高，明顯改善了青貯的發(fā)酵品質(zhì)。Ohshima等［28－30］研究表明，20℃條件下添加綠汁發(fā)酵液和接種乳酸菌均可有效地改善苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)，但30℃條件下乳酸菌處理作用效果不明顯，而綠汁發(fā)酵液仍可顯著改善發(fā)酵品質(zhì)，其主要原因在于乳酸菌制劑中僅含有特定的乳酸菌菌種，而綠汁發(fā)酵液中存在適合原料發(fā)酵的多種乳酸菌菌種，因此，綠汁發(fā)酵液能夠在比較廣的青貯環(huán)境條件下發(fā)揮其促進(jìn)乳酸發(fā)酵的作用。許慶芳等［31］報道，與對照組相比，添加綠汁發(fā)酵液可顯著降低苜蓿青貯的pH值和丁酸含量，減少非蛋白氮含量，增加乳酸含量。莊益芬等［32］研究表明，綠汁發(fā)酵液組的pH值、氨態(tài)氮和氣體損失率都極顯著降低，而干物質(zhì)回收率顯著升高。因為綠汁發(fā)酵液能在青貯發(fā)酵初期顯著提高乳酸菌基數(shù)，使乳酸菌旺盛繁殖，產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低青貯的pH值，有效抑制不良微生物的活動，并減少干物質(zhì)損失。

纖維素酶作為青貯添加劑的應(yīng)用，越來越受到人們的關(guān)注。纖維素酶能夠降解青貯原料中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物為單糖或雙糖，為乳酸菌的發(fā)酵提供更多可利用的底物，并減少干物質(zhì)的損失［33］。本試驗添加CEL處理的青貯料，pH和NDF均顯著低于對照，DMR顯著高于對照，青貯料的NH3－N含量顯著降低（W5M5除外）。Dewar等［34］研究多年生黑麥草（Loliumperenne）、意大利黑麥草和鴨茅（Dactylisglomerata）的半纖維素酶類時，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過7d處理的多年生黑麥草半纖維素每kg基底物質(zhì)最高可產(chǎn)生228g的糖，分析產(chǎn)出的糖類表明這些主要是木糖和阿拉伯糖，這2種糖都是可溶性的，也就是說都是乳酸菌可以利用來發(fā)酵的底物。纖維素酶可有效解決青貯發(fā)酵底物不足和纖維含量過高的問題，并且抑制氨的產(chǎn)生，提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)［35］。本試驗添加CEL，顯著提高了W5M5的WSC，而對其他混合比例青貯的WSC有所升高但無顯著差異。原因可能為：1）水葫蘆原料的WSC含量低，僅為2.29%，混合青貯中玉米秸稈比例越低，發(fā)酵底物WSC越缺乏，纖維素酶降解結(jié)構(gòu)性碳水化合物產(chǎn)生的WSC被乳酸菌利用的量越多，青貯料中剩余量則較少；2）纖維素酶在青貯中的效果不一致［36－40］。李靜等［36］報道添加纖維素酶有改善稻草青貯料發(fā)酵品質(zhì)和飼用價值的作用。Sheperd和Kung［37］添加纖維素酶于玉米青貯中，發(fā)現(xiàn)不同劑量的酶對發(fā)酵過程中酸的產(chǎn)生均無影響；Kung等［38］在苜蓿半干青貯中添加細(xì)胞壁降解酶，沒有明顯提高青貯發(fā)酵。植物細(xì)胞壁是由纖維素搭成主干骨架，其中填充有大量半纖維素、果膠和木質(zhì)素等，這些物質(zhì)相互交融混合構(gòu)成了極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)體系。該結(jié)構(gòu)體系的復(fù)雜程度和抗降解性依植物種類、部位及成熟程度等的不同而異。故常有纖維素酶難以將細(xì)胞壁徹底裂解、添加無效的現(xiàn)象。纖維素酶是一種微生物制劑，對溫度、濕度、酸、堿等敏感，故青貯原料理化特性的不同也是導(dǎo)致使用效果不一致的因素。

許多研究結(jié)果表明［39，40］，綠汁發(fā)酵液與纖維素酶共同作用的效果明顯優(yōu)于單獨使用，具有相乘效果。這是因為綠汁發(fā)酵液的添加彌補了青貯原料中乳酸菌數(shù)量的不足，加快了乳酸發(fā)酵的啟動，纖維素酶能夠降解青貯原料中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物為單糖或雙糖，為乳酸菌的發(fā)酵提供更多可利用的底物，二者協(xié)同作用，可在較短時間內(nèi)使乳酸菌迅速繁殖，產(chǎn)生大量乳酸，快速降低pH，有效抑制其他菌群的活動。pH值的快速降低還有助于抑制植物酶的活性，抑制蛋白質(zhì)降解成氨態(tài)氮，減少蛋白質(zhì)損失。

4 結(jié)論

甜玉米秸稈混合比例越高，青貯效果越好；添加綠汁發(fā)酵液和纖維素均能提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)，綠汁發(fā)酵液和纖維素酶同時添加具有相乘作用。另外，添加劑的使用，不僅能夠有效提高混合青貯的發(fā)酵品質(zhì)，還能降低可調(diào)制優(yōu)質(zhì)水葫蘆玉米秸稈混合青貯中玉米秸稈的比例。這對于玉米種植量少，而水葫蘆頗多的南方地區(qū)來說具有重要意義。

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