菊芋內(nèi)生固氮菌分離、鑒定及特性研究

孟憲法，隆小華，康健，王雪晴，劉兆普

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 江蘇省海洋生物學(xué)重點實驗室，江蘇 南京210095）

生物固氮是自然界中僅次于光合系統(tǒng)的復(fù)雜生物反應(yīng)系統(tǒng)。它為全球的植物提供了大約75%的氮素，達1.39×108～1.75×108t［1，2］。生物固氮在提高土壤肥力、增強植物抗病能力等方面也發(fā)揮著極其重要的作用［3］。1966年，D?bereiner［4］首次成功地從熱帶禾本科植物點狀雀稗（Paspalumnotatum）根際中分離出具有較強固氮作用的雀稗固氮菌（Azotobacterpaspali），并于1976年提出根際聯(lián)合固氮的概念。1997年Baldani等［5］根據(jù)菌體能否定殖（植）在植物組織內(nèi)，將固氮菌劃分為自生固氮菌、共生固氮菌和內(nèi)生固氮菌。內(nèi)生固氮菌與植物之間具有聯(lián)合固氮作用，它存在于植物細胞間隙，是介于根際自生固氮和結(jié)瘤共生固氮之間的一種過渡類型［6，7］。內(nèi)生固氮菌通過分泌植物生長激素等多種生理活性物質(zhì)，與病原菌競爭營養(yǎng)和空間等方面促進植物生長，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中具有廣闊的應(yīng)用前景［8，9］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對這類非豆科植物特殊的根際聯(lián)合固氮菌展開了廣泛研究，陸續(xù)在水稻（Oryzasativa）［10，11］、玉米（Zeamays）［12，13］、甘蔗（Saccharumofficinarum）［14，15］等禾本科植物的組織中分離出植物內(nèi)生固氮菌。

菊芋（Helianthustuberosus）是菊科向日葵屬多年生草本植物，又稱洋姜、鬼子姜，為耐寒、耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿植物［16］。原產(chǎn)北美洲，17世紀傳入歐洲，后傳入中國?，F(xiàn)在在全球的熱帶、溫帶、寒帶以及干旱、半干旱地區(qū)都有菊芋的分布。菊芋生態(tài)適應(yīng)性強，其塊莖中富含菊糖，可作為乙醇生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原料［17］。在生產(chǎn)實踐中，菊芋施肥量較少，尤其是氮肥，每hm2僅需75kg的尿素［18］，為水稻用量的50%。且生物量巨大，每hm2每年可以收獲80 000kg左右的菊芋塊莖，以及40 000kg秸稈［19］。這可能是與其自身固氮作用有關(guān)，因而本試驗對菊芋的內(nèi)生固氮菌開展研究，探究菊芋內(nèi)生固氮菌的部分特性，為將來進一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也可為開發(fā)優(yōu)質(zhì)環(huán)保的生物菌肥提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料為南芋一號，2009年10月采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇大豐“863”中試基地。將生長旺盛的菊芋連根拔起，切取其根系，無菌水將附著的泥土清洗干凈，立即用滅菌袋密封，途中置于冰盒中保持低溫，至實驗室后立即放入－20℃冰箱中保存待用。

1.1.2 培養(yǎng)基 Ashby培養(yǎng)基（1 000mL）：用以篩選、培養(yǎng)內(nèi)生固氮菌的無氮培養(yǎng)基，KH2PO40.2g，CaCO35g，MgSO4·7H2O 0.2g，甘露醇 10g，NaCl 0.2g，瓊脂 18g，CaSO4·2H2O 0.1g，pH 7.0±0.2。

Pikovaskaia’s培養(yǎng)基（1 000mL）：用以檢測細菌溶解無機磷的能力，Ca3（PO4）23.0g，蔗糖 10.0g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.2g，酵母粉0.5g，MnSO41mL （4mg／L），F(xiàn)eSO4（Fe·EDTA）0.1mL（2mg／L），瓊脂15g，pH 7.0±0.2。

CCM 培養(yǎng)基（1 000mL）：用以檢測細菌的IAA分泌活性，甘露醇5.0g，蔗糖5.0g，乳酸0.5mL，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO40.2g，K2HPO40.8g，CaCl2·2H2O 0.06g，NaCl 0.1g，NaMoO4·2H2O 2.5mg，酵母粉0.1g，Na·Fe·EDTA 4mL（1.64%），NH4NO31g，色氨酸0.1g，pH 7.0±0.2。

1.2 固氮菌分離及固氮酶活性測定

1.2.1 固氮菌的分離 菊芋根系采用流水沖洗1h，稍拭干，稱取1g，用70%的酒精浸泡30～60s，2%的NaClO溶液處理5min，進行表面滅菌，無菌水沖洗4次，并將最后1次沖洗過的無菌水進行涂布，檢測消毒是否徹底［20］。

消毒后的菊芋根須用無菌的研缽研磨成漿，轉(zhuǎn)入無菌三角瓶中，靜置一段時間后，吸取上清液，梯度稀釋至10－5～10－8后，分別取100μL涂布于Ashby培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～4d。挑取培養(yǎng)特征相異的單個菌落純化，鏡檢，斜面保存。交替在LB培養(yǎng)基和Ashby培養(yǎng)基平板上劃線轉(zhuǎn)接7～8次，能夠正常生長的菌株為固氮菌株，待測其固氮酶活性。

1.2.2 固氮酶活性檢測 純化得到的固氮菌，利用乙炔還原法檢測固氮酶活性，以篩選獲得具有高固氮活性的菌株。將LB液體培養(yǎng)的固氮菌，稀釋至菌體濃度為108個／mL，取0.5mL稀釋菌液與Ashby半固體培養(yǎng)基2 mL混勻后，培養(yǎng)于青霉素小瓶中，封口膜封口，每一菌株3個重復(fù)，28℃培養(yǎng)2d。在無菌的條件下將封口膜換成橡膠塞，用石蠟密封，28℃下繼續(xù)培養(yǎng)2d。用無菌注射器從瓶內(nèi)抽取0.5mL的空氣，隨即注入0.5mL高純度的C2H4，相同溫度下培養(yǎng)2d。從瓶中抽取混合氣體1mL注入GC5890C型氣相色譜議中檢測乙烯含量。色譜條件：氧化鋁柱長3m，內(nèi)徑0.53mm，柱溫為55℃，檢測器溫度為220℃，進樣器溫度為160℃，載氣為N2，檢測器為火焰離子發(fā)生器（FID）。按下式計算固氮酶活性［21］。

其中，hx：樣品峰值；hs：標準 C2H4峰值；c：標準 C2H4濃度（nmol／mL）；v：培養(yǎng)容器體積（mL）；t：樣品培養(yǎng)間（h）；N：產(chǎn)生的C2H4濃度（nmol／mL·h）；24.9：常數(shù)，為標準濃度的C2H4在30℃下測試時的體積（mL）。

1.3 固氮菌菌株鑒定［21］

鑒定所得菌株的菌落形態(tài)、對各種碳源的適應(yīng)性、耐鹽性以及各種生化反應(yīng)，以明確菌株的形態(tài)特性，生理生化特性等。通過菌株16SrRNA的檢測分析，確定其菌屬。

1.3.1 菌落形態(tài)特性 取0.1mL菌體濃度為108個／mL的稀釋菌液，涂布于LB培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2d后觀察菌落形態(tài)特性。

1.3.2 生理生化特性 唯一碳源試驗：分別以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、菊糖、蔗糖、甘露醇作為唯一碳源取代Ashby培養(yǎng)基中的蛋白胨，接種固氮菌，28℃恒溫培養(yǎng)2d后，觀察其生長情況。

耐鹽性：制備供試菌株的稀釋菌液，取0.1mL分別涂布于NaCl濃度為3%～8%的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2d后觀察菌落生長情況。

生化反應(yīng)測定：按照東秀珠和蔡妙英［22］及周德慶［23］的試驗方法，分別檢測供試菌株的油脂水解試驗、M.R.試驗、V.P.試驗、明膠分解試驗、H2S的產(chǎn)生、吲哚試驗、淀粉水解酶試驗、過氧化氫酶試驗及革蘭氏染色等生化反應(yīng)特性。

1.3.3 16SrRNA 序列檢測 使用16SrDNA 的通用引物，進行 PCR 擴增，引物序列：引物1，27f：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′，引物2，1 492r：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′［24］。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。擴增程序為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，58℃退火30s，72℃延長1.5min，30個循環(huán)；72℃下延伸8min。擴增后，取5μL的擴增樣品在1%的瓊脂糖凝膠上130V電壓下進行電泳檢測，將亮度好、純度高的特異性條帶（1 500bp左右）回收之后，置于－20℃下保存，送往上海美季生物技術(shù)有限公司測序，所得基因序列與GeneBank報道序列進行同源性分析。

1.4 固氮菌解磷性及分泌植物生長激素特性檢測

檢測固氮菌株對無機磷的分解作用以及菌株自身分泌吲哚乙酸（IAA）的特性，以利于進一步探究固氮菌對菊芋的促生機理。

1.4.1 解磷性檢測 將1mL供試菌株的懸浮液（1×108個／mL），接種于50mL Pikovaskaia’s液體培養(yǎng)基中，每一菌株3個重復(fù)，置于搖床上，28℃，160r／min，培養(yǎng)10d之后，在4℃下10 000r／min離心15min，對照組除不接種菌株外，處理相同。采用鉬酸銨比色法測定有效磷（P）的含量［25］，標準曲線采用KH2PO4制作。取1mL上清液，5mL鉬銻抗顯色液，定容至50mL，30℃水浴30min后，在700nm波長下，進行比色。

1.4.2 IAA分泌特性檢測 將1mL供試菌株的懸浮液（1×108個／mL）接種于盛有50mL CCM液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每一菌株3個重復(fù)，置于搖床上28℃，160r／min培養(yǎng)12d，對照除不接種菌株外，處理相同。將菌株培養(yǎng)液在4℃10 000r／min離心10min。采用Salkowski比色法［26］測定其產(chǎn)生植物生長激素的能力，標準曲線采用3－IAA制作。取1mL上清液加比色液（0.5mol／L FeCl32mL，高氯酸100mL）后，在黑暗中靜止0.5h后，在530nm波長下，進行比色。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌分離及固氮酶活性

通過對根內(nèi)固氮菌的分離、純化，得到了7株固氮酶活性較高的菌株，編號為cho1～cho5、cho7和cho9。它們之間的固氮酶活性相差較大，為26.74～207.34nmol／（mL·h）。固氮酶活性較高的菌株較少，只有cho1和cho9的固氮酶活性高于100nmol／（mL·h）。菌株cho1的固氮酶活性為207.34nmol／（mL·h），與其他菌株差異顯著（表1）。

2.2 固氮菌形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16SrRNA鑒定

2.2.1 菌落特性 篩選得到的固氮菌株菌落均呈圓形，表面光滑，粘稠，易挑起，但顏色差異較大。菌株cho2和cho7的生長速度較慢，菌株cho3則可以在LB培養(yǎng)基上快速生長（表2）。

表1 菊芋內(nèi)生固氮菌固氮酶活性Table1 Nitrogenase activity of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke nmol／（mL·h）

表2 菊芋內(nèi)生固氮菌菌落形態(tài)特性Table 2 Colony morphology of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

2.2.2 生理生化特性 碳源利用特性結(jié)果分析表明，待測菌株均對葡萄糖、麥芽糖和蔗糖具有較高的適應(yīng)性；菌株cho2和cho4在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長不良；菌株cho2在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長不良；菌株cho2和cho7在以菊糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上適應(yīng)性較差，表現(xiàn)為不生長或生長不良，可見不同菌株對碳源的利用存在著差異（表3）。

表3 菊芋內(nèi)生固氮菌對不同碳源利用特性Table 3 Utilization characteristics of different carbon sources by the endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

待測固氮菌株均能在鹽濃度為5%及以下的培養(yǎng)基上生長，但隨著鹽濃度的增加，不同菌株間耐鹽性差異較大。cho7和cho9具有較高的耐鹽活性，cho4可以在富鹽培養(yǎng)基上正常生長。當鹽濃度到達8%時，菌株均不能生長（表4）。

待測菌株均具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，并可以產(chǎn)生過氧化氫酶，且均為革蘭氏陰性菌；只有菌株cho1、cho3、cho4、cho9可以分解硫氨基酸產(chǎn)生 H2S；固氮菌在油脂、明膠、淀粉等水解試驗中表現(xiàn)各不相同，葡萄糖水解產(chǎn)物也各不相同（表5）。

2.2.3 16SrRNA序列 測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)合固氮菌的生理生化特征（表5），本研究分離篩選出的固氮菌菌株cho1、cho4屬于根瘤菌屬；菌株cho2、cho5、cho7屬于寡養(yǎng)單胞菌屬；菌株cho3屬于假單胞菌屬；菌株cho9屬于腸桿菌屬（表6）。

表4 菊芋內(nèi)生固氮菌對NaCl的耐受性Table 4 NaCl tolerance of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

2.2.4 固氮菌解磷性及分泌植物生長激素特性 待測固氮菌，均具有分泌生長素的能力，產(chǎn)生的IAA濃度為2.67～13.49μg／mL，其中以cho2為最高；除菌株cho3和cho5不具有解磷活性外，剩余5株固氮菌均具有分解無機磷的活性，但解磷活性差異較大（表7）。

3 討論

氮肥在菊芋生物量積累中，起著至關(guān)重要的作用［19］。內(nèi)生固氮菌定植于宿主植物體內(nèi)，受到保護的同時，可有效的為植物提供氮素營養(yǎng)，且不需要與特異性宿主結(jié)成根瘤，提高了內(nèi)生固氮菌的應(yīng)用范圍。同時內(nèi)生固氮菌大多數(shù)還具有溶解有機磷、礦物磷，以及分泌植物激素的特性，增強了植株的抗病性和適應(yīng)性［7］。在研究中發(fā)現(xiàn)，菊芋對土壤肥力要求低，可以在少量施加甚至不施加氮肥的中度和輕度鹽堿地生長良好。在施氮量不足的條件下，菊芋的總生物量可以達到15 000kg／（hm2·年）以上，土壤中氮素處于凈消耗狀態(tài)［27］。從微生物角度入手，在發(fā)現(xiàn)菊芋根際固氮菌的數(shù)量沒有顯著增加的情況下，從根系中分離得到了7株性狀良好的內(nèi)生固氮菌，分別為2株根瘤菌屬，3株寡養(yǎng)單胞菌屬，1株假單胞菌屬和1株腸桿菌屬。與禾本科植物相比，菊芋根系中的內(nèi)生固氮菌的種類較為單一，除常見的內(nèi)生固氮菌［28，29］，如根瘤菌、假單胞桿菌和腸桿菌外，首次發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）。

表5 菊芋內(nèi)生固氮菌的生化反應(yīng)特性Table 5 Biochemical characteristics of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

表6 菊芋內(nèi)生固氮菌菌株名錄Table 6 Name list of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

表7 菊芋內(nèi)生固氮菌的解磷性及產(chǎn)生的IAA濃度Table 7 P dissolution ability and concentration of IAA in exudates of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke μg／mL

菊芋內(nèi)生高固氮酶活性的菌株較少，但性狀良好，它們具有較好耐鹽能力，均可在5%的NaCl濃度下正常生長，菌株cho4甚至可以在7%的高鹽培養(yǎng)條件下生長。除cho3和cho5外的固氮菌，均具有解磷活性，可以分解土壤中的難溶無機磷，將之轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟梢晕绽玫挠行Я姿兀岳诰沼笤诹姿剌^少的土壤中生長。所得菌株均具有較高的IAA分泌的特性，分泌的IAA可促進菊芋生長，也可促進菊芋根系對土壤中的水分和養(yǎng)分的吸收并可為有益菌附生創(chuàng)造有利條件，這與許多學(xué)者的研究結(jié)果相一致［30］。

綜上，試驗中從菊芋根部篩選得到的固氮菌株，具有高效的固氮酶活性，能夠從空氣中固定大量的氮。這使菊芋具備了耐貧瘠的特性，即使不施加氮肥，也可以積累較高的生物量。同時，菌株還具有良好的解磷性和植物激素的分泌特性，增強了菊芋的抗逆性，也是菊芋粗放種植、適合鹽堿化土壤生長非耕地的可能原因之一。

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