內(nèi)生真菌對感染銹病黑麥草生長和生理的影響

馬敏芝，南志標(biāo)

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)部草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)學(xué)重點開放實驗室 甘肅草原生態(tài)研究所，甘肅 蘭州730020）

多年生黑麥草（Loliumperenne）作為廣泛建植的冷季型草坪草，具有分蘗能力強、成坪速度快、耐踐踏和綠期長等特點，是歐美國家和我國常用的一種草坪建植草種［1］。禾草內(nèi)生真菌是指生長在植株體內(nèi)并完成全部或大部分生活周期，而不顯示外部癥狀的一大類真菌［2］。Neotyphodiumlolii內(nèi)生真菌與多年生黑麥草形成的共生體可提高寄主和微生物抵御生物因素和非生物因素脅迫的生態(tài)適應(yīng)性［3］。

黑麥草屬植物易感染多種病害，其中銹病是危害草坪黑麥草的一類常見真菌病害［4］。有研究報道黑麥草易發(fā)生冠銹病（Pucciniacoronata）、條銹?。≒ucciniastriifomis）和葉銹?。≒ucciniarecondita）等［5－7］，主要癥狀為葉片或莖稈表面形成不規(guī)則的褪色斑，后變?yōu)辄S色粉狀孢子堆，受害草坪生長緩慢，嚴(yán)重時大面積變黃直至成片死亡［8，9］。目前，化學(xué)殺菌劑可有效地防治植物真菌引起的病害，與農(nóng)田和其他農(nóng)作物相比，草地面積大，使用殺菌劑不甚經(jīng)濟，易造成生態(tài)環(huán)境的污染［10］，并使植物產(chǎn)生抗藥性［11］。因此，積極采用微生物防治手段是控制病害經(jīng)濟有效的措施［12］。研究［13，14］表明，帶有內(nèi)生真菌的禾草不僅對一些植物病害有抗性而且對禾草生產(chǎn)力的提高起到重要作用。如在自然環(huán)境中，帶內(nèi)生真菌的多年生黑麥草比不帶菌植株對冠銹病表現(xiàn)出較強的抗性［15］，也有田間試驗證實內(nèi)生真菌感染并未提高寄主的抗病性［16］。這可能是由于植物抗病性本身就是一個非常復(fù)雜的過程，受寄主、病害以及環(huán)境等多方面因素的影響而表現(xiàn)出不一致［17］。本研究對田間黑麥草被銹病侵染后的植株生長、體內(nèi)保護(hù)酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等一些相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，探討了保護(hù)酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在黑麥草抵御銹病侵害中的作用，比較帶內(nèi)生真菌和不帶內(nèi)生真菌黑麥草在銹病脅迫下的抗病性差異，為黑麥草－內(nèi)生真菌共生體抗病的進(jìn)一步研究及合理利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

坪用多年生黑麥草（球道品種Fairway）的種子購于蘭州邵明草坪公司，4℃保存于農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（蘭州）儲藏室。

1.2 方法

1.2.1 帶菌（E＋）與不帶菌（E－）種群的建立 將黑麥草種子播種于育苗盤中（30cm×25cm×8cm），置于室外培養(yǎng)，人工遮雨，隔天澆水。自然條件下生長一個月后待幼苗長有3至4個分蘗時，參照南志標(biāo)［18］的方法進(jìn)行葉鞘帶菌率檢測并作標(biāo)記，然后將檢測好的幼苗移栽至蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院模擬試驗田中（2.4m×2.7m），建立帶菌（E＋）與不帶菌（E－）種群。

1.2.2 銹病病害調(diào)查及嚴(yán)重度分級 于2009年10月中旬對自然發(fā)生銹病的黑麥草進(jìn)行田間病害調(diào)查，對所有種群進(jìn)行Z字型5點取樣法，每點隨機調(diào)查5株，統(tǒng)計發(fā)病率。

在參考燕麥冠銹?。≒.coronata）以及長芒草銹?。║redosp.）嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上［19，20］，結(jié)合實際情況確定黑麥草銹病的嚴(yán)重度。參照南志標(biāo)等［21］的方法，規(guī)定0級的為健株，1～3級為輕度病株，4～5級為重度病株。

1.2.3 生物量、株高測定 分別在健株、輕度病株和重度病株中，取5株為1個處理，共4個重復(fù)，用毫米刻度尺測量黑麥草各處理的株高。同樣取30片葉為1個處理，共4個重復(fù)，用去離子水快速沖洗掉表面的泥土和雜質(zhì)，置于烘箱內(nèi)105℃殺青20min，80℃烘48h至恒重，然后稱重。按下列公式計算病葉損失率和病株矮化率。

1.2.4 光合指標(biāo)測定 在室外選擇天氣晴朗上午9：00－11：00，從每組處理植株中隨機選取發(fā)病葉片，于普通空氣條件下采用Li－6400便攜式光合儀測定連體葉片，每個處理重復(fù)測定15次。測定參數(shù)包括葉片的凈光合速率（Pn，μmol／m2·s）、蒸騰速率（Tr，μmol／m2·s）和氣孔導(dǎo)度（Gs，mmol／m2·s）等指標(biāo)。當(dāng)日測定溫度為（18±2）℃，光合有效輻射為（500±20）μmol／（m2·s）。

1.2.5 生理生化指標(biāo)測定 植株的葉片相對含水量采用飽和稱重法［22］；葉綠素含量與可溶性糖含量測定分別采用李合生［23］的丙酮浸提法和蒽酮比色法。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、游離脯氨酸（free proline，Pro）以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定分別采用李合生［23］的氮藍(lán)四唑法、愈創(chuàng)木酚法、磺基水楊酸法和硫代巴比妥酸法。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 銹病病原鑒定

田間黑麥草E＋、E－植株于2009年9月開始自然發(fā)生銹病，主要發(fā)生在葉片部位，起初為小丘斑狀，孢子堆小形，鮮黃色，不穿透葉片；孢子成熟后使寄主表皮破裂，露出粉末狀黃褐色夏孢子堆，夏孢子單胞，圓形或長圓形，淡黃褐色，表面有小刺，大小19.00～22.25μm×14.25～18.50μm，病原菌歸為擔(dān)子菌亞門柄銹屬（Pucciniaspp.）的真菌［8］。

2.2 對生物量及株高的影響

黑麥草感染銹病后，其E＋和E－植株的發(fā)病率分別為21.92%和65.02%。株高和生物量隨著發(fā)病程度的加重而減少，其中輕度和重度病株中E＋植株的株高和地上生物量顯著高于E－植株（P＜0.05）。輕度和重度病株中E＋植株的病葉損失率顯著低于E－植株（P＜0.05）。在重度病株中E＋植株的病株矮化率顯著低于E－植株（P＜0.05），而輕度病株中E＋和E－植株的病株矮化率差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

2.3 對光合指標(biāo)的影響

感染銹病的E＋和E－植株的葉片凈光合速率、蒸騰速率以及氣孔導(dǎo)度均呈下降趨勢。輕度病株和重度病株中的E＋葉片凈光合速率顯著高于E－葉片（P＜0.05），分別高出71.74%和77.95%。健株中的E＋和E－葉片的凈光合速率差異不顯著（P＞0.05）。同樣在輕度病株和重度病株中，E＋葉片的蒸騰速率顯著高于E－葉片（P＜0.05），分別高出64.54%和55.46%。E＋和E－植株的葉片蒸騰速率在健株無顯著性變化（P＞0.05）。在輕度和重度病株處理中，E＋植株葉片的氣孔導(dǎo)度顯著高于E－植株（P＜0.05），分別高出26.13%和45.54%。E＋植株中輕度病株的氣孔導(dǎo)度與健株差異不顯著（P＞0.05），而重度病株的氣孔導(dǎo)度與健株差異顯著（P＜0.05）；E－植株中輕度病株和重度病株的氣孔導(dǎo)度與健株差異顯著（P＜0.05）（表2）。

表1 不同發(fā)病程度對E＋、E－黑麥草株高和生物量的影響Table 1 Effect of different disease severity on height and biomass of E＋ and E－ perennial ryegrass

表2 不同發(fā)病程度對E＋、E－黑麥草凈光合速率、蒸騰速率及氣孔導(dǎo)度的影響Table 2 Effect of different disease severity on stomatal conduction，net photosynthetic and transpiration rate of E＋ and E－ perennial ryegrass

2.4 對生理生化指標(biāo)的影響

黑麥草感染銹病后，所有植株的葉片相對含水量與葉綠素含量均呈下降趨勢，可溶性糖含量則升高。在輕度和重度病株中，E＋植株的葉片相對含水量顯著高于E－植株（P＜0.05），分別高出8.24%和29.35%。與健株相比，輕度和重度病株中E＋、E－植株的葉片相對含水量顯著低于健株（P＜0.05）（表3）。

表3 不同發(fā)病程度對E＋、E－黑麥草葉片相對含水量、葉綠素含量及可溶性糖含量的影響Table 3 Effect of different disease severity on relative water content，chlorophyll and soluble sugar content of E＋ and E－ perennial ryegrass

健株和輕度病株中，E＋與E－植株之間的葉綠素含量差異不顯著（P＞0.05），在重度病株中，E＋植株的葉綠素含量比E－植株高64.52%，差異顯著（P＜0.05）。說明銹菌侵染后，葉綠體被破壞，葉綠素含量下降，從而抑制葉片的正常光合作用（表3）。

輕度病株和重度病株中E＋植株的可溶性糖含量顯著高于E－植株（P＜0.05），分別高出17.09%和28.2%。E＋和E－植株的可溶性糖含量在健株上差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

黑麥草感染銹病后，所有E＋與E－植株的脯氨酸含量與未發(fā)生銹病的植株相比均顯著升高（P＜0.05）。輕度和重度病株中，E＋植株的脯氨酸含量顯著高于E－植株（P＜0.05），分別高出25.70%和22.64%。E＋和E－植株的脯氨酸含量在健株上無顯著差異（P＞0.05）（表4）。并且各發(fā)病程度植株的SOD與POD活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。其中輕度和重度病株上E＋植株的SOD活性顯著高于E－植株（P＜0.05），二者分別高出16.87%和24.54%，而E＋和E－植株的SOD活性在健株上差異不顯著（P＞0.05）。輕度病株中E＋植株的POD活性顯著高于E－植株（P＜0.05），高出39.52%，E＋和E－植株的POD活性在健株上無顯著差異（P＞0.05）（表4）。

與健株相比，各發(fā)病程度植株的MDA含量增加。其中在輕度和重度病株中，E＋植株的MDA含量顯著低于E－（P＜0.05），分別降低49.56%和62.30%。E＋和E－植株的MDA含量變化在健株上差異不顯著（P＞0.05）（表4）。

表4 不同發(fā)病程度對E＋、E－黑麥草酶活性、脯氨酸及丙二醛含量的影響Table 4 Effect of different disease severity on enzyme activities，proline and MDA content of E＋ and E－ perennial ryegrass

3 討論

本研究首次探討了田間黑麥草發(fā)生銹病后，內(nèi)生真菌對寄主生長、光合特性及生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，黑麥草感病后E＋植株的株高和生物量均顯著高于E－植株（P＜0.05），并且E＋植株的病株矮化率和病葉損失率顯著低于E－植株（P＜0.05），說明在逆境的脅迫下，內(nèi)生真菌對黑麥草具有促進(jìn)生長的作用。這與Bacon和Siegel［24］證實內(nèi)生真菌的感染可提高多年生黑麥草生長能力的結(jié)論相類似。

光合作用是衡量植物生長狀況的重要指標(biāo)，而葉綠素是植株進(jìn)行光合作用時必不可少的物質(zhì)，其含量的下降則影響植物的正常光合作用，病原微生物的侵染會破壞葉片綠色組織，減少植物的正常光合面積，從而減弱光合作用［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，銹菌侵染黑麥草后所有感病植株的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度都呈下降趨勢，但E＋植株的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均顯著高于E－植株（P＜0.05）。內(nèi)生真菌可減緩黑麥草中葉綠素含量的下降，在一定程度上增強了植株的光合性能，從而提高植株的抗病性。這與Amalaric等［26］研究多年生黑麥草E＋植株的氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率以及凈光合速率高于E－植株以及Belesky等［27］研究內(nèi)生真菌可以提高禾本科草坪草的光合作用以降低生物脅迫對寄主的壓力等結(jié)論相一致。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是內(nèi)生真菌的存在拓展了寄主的葉片面積、提高葉片的延展性［28］從而降低銹病對黑麥草的脅迫強度。

本研究發(fā)現(xiàn)，感染銹病的黑麥草其葉綠素的含量顯著低于健株（P＜0.05），降低的原因可能是病原菌侵入會破壞葉綠體并抑制葉綠素的合成，使植物代謝異常從而受到危害［29］。這與南志標(biāo)等［30］對苜蓿褐斑?。≒seudopezizamedicaginis）的研究結(jié)果相類似。植物在逆境條件下生長受到抑制，糖利用減少，葉片內(nèi)可溶性糖含量增加并能從多條代謝途徑得到，因此在植物受到病原菌侵染時可以快速、大量地合成用來調(diào)節(jié)植物的滲透勢，減少逆境對植物的損害［31］。本研究中，無論感病輕重，E＋植株的葉片相對含水量、葉綠素含量和可溶性糖含量均顯著高于E－植株（P＜0.05），產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是內(nèi)生真菌的存在可抵御病原菌的侵入和擴展，從而降低病原菌對葉綠體的破壞程度。除此之外，內(nèi)生真菌可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，增強植株的抗病能力以減小銹病對黑麥草的危害。這些結(jié)果與張興旭等［32］研究醉馬草（Achnatheruminebrians）在禾谷縊管蚜（Rhopalosiphumpadi）的危害下得出內(nèi)生真菌可緩解植株葉片相對含水量和葉綠素含量下降的結(jié)論相類似。研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后，野大麥（Hordeumbrevisubulatum）E＋種群比E－種群的葉片中能積累更多的可溶性糖以提高寄主的抗逆性［33］。

有研究證實，正常狀態(tài)下植物體內(nèi)由于活性氧清除酶系統(tǒng)（SOD，POD，CAT等）的存在而使得活性氧代謝處于動態(tài)平衡狀態(tài)［34］。當(dāng)植物受到生物或非生物因子脅迫時，體內(nèi)的活性氧含量會升高，可導(dǎo)致植物蛋白和膜質(zhì)的非特異性氧化［17］，從而產(chǎn)生大量的自由基，其中MDA含量高低是膜質(zhì)過氧化作用強弱的一個重要指標(biāo)，抗病性較強的植株體內(nèi)膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較低，抗病性較差的則相反［35］。本研究中，E＋植株在銹病不同發(fā)病程度下其葉片的MDA含量顯著低于E－植株（P＜0.05），分別降低49.56%和62.30%。此結(jié)果表明，內(nèi)生真菌能夠降低植物體內(nèi)MDA的含量，有效地保護(hù)黑麥草膜系統(tǒng)進(jìn)而提高其抗病性。脯氨酸是植物細(xì)胞質(zhì)中的一種氨基酸，具有滲透調(diào)節(jié)作用。植物受脅迫時，脯氨酸的積累可保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，維持胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)，減少胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解［36，37］。本研究發(fā)現(xiàn)，輕度和重度病株中，E＋植株的脯氨酸含量、SOD活性以及POD活性顯著高于E－植株（P＜0.05），這與Tian等［17］在研究黑麥草接種病原菌后，內(nèi)生真菌可提高葉內(nèi)SOD活性以及POD活性的結(jié)論相類似。Zhang和Nan［38］的研究證實，在水分脅迫下內(nèi)生真菌可提高披堿草（Elymusdahuricus）體內(nèi)脯氨酸含量以及保護(hù)酶系統(tǒng)的活力，從而抵御不良環(huán)境的干擾。這說明在生物或非生物脅迫下，內(nèi)生真菌可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生更多的清除氧自由基的保護(hù)酶，減緩細(xì)胞受傷害程度，增強寄主抗逆性。

本研究證明內(nèi)生真菌的存在可提高寄主在田間條件下的抗銹病能力，為黑麥草－內(nèi)生真菌共生體的合理利用及抗病方面的研究提供基礎(chǔ)，其抗病機制尚待進(jìn)一步研究。

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