氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片保護(hù)酶活性和膜脂過氧化的影響

匡藝，李廷軒，余海英

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川 雅安625014；2.四川威遠(yuǎn)縣環(huán)境監(jiān)測(cè)站，四川 威遠(yuǎn)642450）

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，作物全株光合產(chǎn)物的90%～95%來自光合作用，光合時(shí)間的長(zhǎng)短主要取決于葉片衰老的進(jìn)程。自20世紀(jì)70年代，自由基傷害假說引入作物衰老研究以來活性氧自由基與作物衰老關(guān)系的研究成為學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)［1］。研究表明，當(dāng)作物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，其清除活性氧自由基系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（superxoide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）會(huì)迅速啟動(dòng)，來共同抵抗外界脅迫帶來的危害［2］。而活性氧毒害引發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)生的丙二醛（malondialdehyde，MDA），其含量的高低亦可反應(yīng)細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)逆境脅迫反應(yīng)的強(qiáng)弱［3］。氮是作物所需最多的營(yíng)養(yǎng)元素，其在作物的保護(hù)酶代謝中起著重要作用。作物抗性生理的有關(guān)研究表明，細(xì)胞中SOD、POD、CAT活性和MDA含量變化因供氮量、作物品種、生育期不同而有很大的差異。據(jù)劉連濤等［4］報(bào)道，氮素缺乏會(huì)引起棉花（Gossypiumhirsutum）丙二醛含量升高，加速葉片的衰老。魏海燕等［1］對(duì)不同氮利用效率水稻（Oryzasativa）的研究表明，齊穗后的不同時(shí)期，氮高效水稻基因型的SOD、POD和CAT活性均顯著高于氮低效基因型，而MDA的含量顯著低于氮低效基因型。飼草作為畜牧業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其產(chǎn)量的高低對(duì)作物－家畜綜合系統(tǒng)的生產(chǎn)力產(chǎn)生重要影響。當(dāng)前，施用氮肥是增加飼草［5，6］與種子［7］產(chǎn)量、提高經(jīng)濟(jì)效益［8］、促進(jìn)養(yǎng)分吸收［9］、改善品質(zhì)［10］的主要手段。然而隨著施氮量的增加，產(chǎn)投比下降，這在降低氮肥利用效率，帶來資源浪費(fèi)的同時(shí)，也導(dǎo)致了水體富營(yíng)養(yǎng)化等一系列環(huán)境問題。已有的研究表明，作物在吸收利用氮素方面普遍存在著基因型差異［13－15］，這使得挖掘作物自身吸收利用氮素的潛力，成為提高農(nóng)田氮肥利用率、減少氮素?fù)p失的有效途徑［16］。小黑麥（Triticosecale）作為禾本科牧草中的優(yōu)良種，在我國(guó)飼草中占有重要的地位［17］。目前針對(duì)小黑麥的研究多集中于品質(zhì)［18］、高產(chǎn)評(píng)價(jià)［19］、水鹽脅迫［20，21］等方面，對(duì)于氮素供應(yīng)對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片保護(hù)酶活性和膜脂過氧化隨生育期變化的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究擬通過研究供氮水平對(duì)不同氮效率小黑麥基因型在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和最佳刈割時(shí)期－抽穗期［22］時(shí)葉片保護(hù)酶活性和膜脂過氧化的影響，以及它們與地上部生物量的相關(guān)性，以期揭示不同氮效率小黑麥基因型對(duì)氮肥利用差異的可能原因及機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

依據(jù)2008－2009年的研究分類與評(píng)價(jià)，選取2個(gè)具有不同氮利用效率特征的小黑麥基因型為材料，分別為氮低效利用基因型（CIxt74），氮高效利用基因型（PI429186）。盆栽用土為青衣江河流沖積物發(fā)育而來的潮土，采自四川省雅安市雨城區(qū)大興鎮(zhèn)。其基本理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)9.07g／kg、全氮0.36g／kg、堿解氮25.74mg／kg、速效磷9.45mg／kg、速效鉀36.32mg／kg，pH 6.12。所用尿素含N 46.70%，磷酸二氫鉀含P2O552.17%、含K2O 34.53%，硫酸鉀含K2O 53.94%；其中尿素為市場(chǎng)購(gòu)買，磷酸二氫鉀和硫酸鉀為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)處理

于2009－2010年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研園有防雨設(shè)施的網(wǎng)室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)所用盆體上口徑27 cm，下口徑20cm，高23cm，每盆裝土15kg。據(jù)報(bào)道［23］，150.00kg N／hm2為小黑麥的最佳施氮量，故氮素處理設(shè)0g N／盆（N0）、0.25g N／盆（N1）、0.50g N／盆（N2）、1.00g N／盆（N3）4個(gè)水平，分別相當(dāng)于0，37.50，75.00和150.00kg N／hm2。所有處理的磷、鉀肥用量一致，按P2O50.60g／盆、K2O 0.50g／盆施入。試驗(yàn)共8個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)20次，完全隨機(jī)排列。其中60%氮肥和所有磷鉀肥配制成溶液在播種前5d與土壤充分混勻，其余40%氮肥作為追肥在拔節(jié)期施用。播種前選取飽滿的種子，用50%多菌靈消毒后堆悶6h。2009年11月25日播種，每盆播10粒種子，及時(shí)補(bǔ)種，于2009年12月29日，定苗為8株。全生育期進(jìn)行病蟲害防治并適時(shí)灌溉，采用自然光照。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

在小黑麥的苗期（出苗后47d）、分蘗期（出苗后82d）、拔節(jié)期（出苗后102d）和抽穗期（出苗后140d）進(jìn)行采樣，每次采樣每個(gè)處理取4次重復(fù)。采樣時(shí)將盆栽土壤和植株傾盆倒出，以免破壞植株完整根系。采收后，先用自來水洗凈葉片表面灰塵和污物，然后用蒸餾水潤(rùn)洗，再用吸水紙將葉片附著的水分吸干。取同一盆中4株小黑麥用于葉片和根系生理測(cè)定，其余4株用于植物含氮量和根系形態(tài)的測(cè)定。將用于測(cè)定葉片生理的樣品剪碎、混勻，液氮速凍后存于－80℃超低溫冰箱中用于保護(hù)酶活性與膜脂過氧化產(chǎn)物的分析。用氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定SOD活性［24］；愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性［25］；過氧化氫法測(cè)定CAT活性［26］；硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定 MDA含量［24］。將樣品根系和地上部剪斷分開，于烘箱中105℃殺青30min，將溫度調(diào)至75℃烘干至恒重，然后測(cè)定其干重。土壤基本理化性質(zhì)采用常規(guī)分析方法［27］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003、唐啟義和馮明光［28］的DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型生物量的影響

各生育期小黑麥地上部生物量存在顯著的基因型差異（表1）。氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，其地上部生物量顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在苗期各供氮條件下，其地上部生物量為氮低效基因型的1.12，1.93，1.64和1.67倍；分蘗期為氮低效基因型的1.18，1.02，1.27和1.30倍；拔節(jié)期時(shí)為氮低效基因型的1.26，1.22，1.16和1.37倍；到最佳刈割時(shí)期－抽穗期為氮低效基因型的1.15，1.09，1.16和1.21倍。針對(duì)同一小黑麥基因型，除苗期供試小黑麥基因型地上部生物量隨供氮量的增加其增產(chǎn)效果不明顯外，其余各生育期地上部生物量隨供氮量的增加而增大。在分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期時(shí)，氮高效小黑麥基因型在正常供氮條件下，其地上部生物量分別比不施氮條件增產(chǎn)84.49%，40.49%和40.43%；對(duì)氮低效基因型而言，其地上部生物量分別比不施氮條件下增產(chǎn)66.87%，29.64%和33.15%。這表明，在正常供氮條件，氮高效基因型隨供氮量增加的增產(chǎn)效果大于氮低效基因型。

表1 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型地上部生物量的影響Table 1 Effects of nitrogen on biomass of shoot in triticale genotypes with different N use efficiency g／株 Plant

2.2 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片保護(hù)酶活性的影響

2.2.1 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片SOD活性的影響 SOD是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的關(guān)鍵酶，能催化生物體內(nèi)分子氧活化的第一中間產(chǎn)物——超氧自由基（O2·－）發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O2，其活性大小是植株衰老和抗性的良好指標(biāo)。各生育期小黑麥SOD活性存在顯著的基因型差異（表2），氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，SOD活性顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，其苗期SOD活性為氮低效基因型的1.08，1.03，1.18和1.31倍；分蘗期為氮低效基因型的1.13，1.07，1.34和1.17倍；拔節(jié)期為氮低效基因型的1.20，1.25，1.19和1.10倍；到最佳刈割時(shí)期——抽穗期為氮低效基因型的1.11，1.12，1.29和1.19倍。針對(duì)同一生育期同一小黑麥基因型，其SOD活性隨供氮量的增加而增強(qiáng)，且其活性在N2和N3條件下達(dá)到較強(qiáng)值。正常供氮條件下，小黑麥氮高效基因型在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時(shí)其SOD活性分別比不施氮條件下提高了26.43%，6.27%，23.04%和21.14%；而氮低效基因型，其SOD活性分別比不施氮條件下提高了4.34%，2.38%，34.41%和13.29%。這表明，在正常供氮條件下，氮高效基因型的SOD活性增強(qiáng)的能力強(qiáng)于氮低效基因型。2.2.2 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片POD活性的影響 POD是細(xì)胞防御活性氧毒害酶系統(tǒng)的成員之一，能催化H2O2氧化其他底物以清除H2O2。各生育期小黑麥POD活性存在顯著的基因型差異（表3），并呈先下降后上升的趨勢(shì)。除苗期和分蘗期，氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，POD活性基本表現(xiàn)出顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，在苗期時(shí)SOD活性為氮低效基因型的1.02，0.78，0.76和0.72倍；分蘗期為氮低效基因型的0.91，1.26，0.96和0.83倍；拔節(jié)期時(shí)為氮低效基因型的0.95，1.04，1.23和0.99倍；到最佳刈割時(shí)期——抽穗期為氮低效基因型的1.11，1.06，1.25和1.10倍。針對(duì)同一生育期同一小黑麥基因型，其SOD活性隨供氮量的提高，規(guī)律性不明顯。正常供氮條件下，分蘗期和抽穗期時(shí)，小黑麥氮高效基因型SOD活性分別比不施氮條件下提高了4.94%和7.07%，在苗期和拔節(jié)期時(shí)下降了12.41%和0.15%；而對(duì)氮低效基因型而言，其SOD活性在苗期、分蘗期和抽穗期時(shí)分別比不施氮條件下提高了24.07%，16.20%和8.31%，在拔節(jié)期時(shí)下降了4.04%。這表明在不同生育期，供氮對(duì)POD活性的影響不一致。

表2 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片SOD活性的影響Table 2 Effects of nitrogen on SOD activity of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency U／g FW

表3 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片POD活性的影響Table 3 Effects of nitrogen on POD activity of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency △OD470／（g FW·min）

2.2.3 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片CAT活性的影響 CAT能夠催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合作用下反應(yīng)生成非常有害的·OH，是植物體內(nèi)主要的保護(hù)酶之一。各生育期小黑麥CAT活性存在顯著的基因型差異（表4），氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，CAT活性基本表現(xiàn)出顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，在苗期時(shí)SOD活性為氮低效基因型的1.71，2.09，1.60和2.10倍；分蘗期為氮低效基因型的1.46，2.25，2.11和1.71倍；拔節(jié)期時(shí)為氮低效基因型的1.04，1.85，1.38和1.48倍；到最佳刈割時(shí)期——抽穗期為氮低效基因型的1.44，1.54，1.45和2.08倍。針對(duì)同一小黑麥基因型，CAT活性在苗期隨供氮量的增加先下降后上降，而在分蘗期和抽穗期時(shí)其活性隨供氮量的增加而加強(qiáng)，在拔節(jié)期時(shí)，則為先上升后下降。正常供氮條件下，小黑麥氮高效基因型在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時(shí)其CAT活性分別比不施氮條件下提高了126.07%，80.48%和247.37%，在苗期時(shí)下降了17.76%；而氮低效基因型，其CAT活性分別比不施氮條件下提高了92.67%，26.70%和96.78%，苗期時(shí)下降了33.81%。這表明雖然在苗期，氮高效基因型的CAT活性在正常供氮條件下，其活性較不供氮下降，但是其降幅較氮低效基因型低，而在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時(shí)，其活性較低效基因型提高明顯。

2.3 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片MDA含量的影響

MDA是植物在逆境和衰老過程中膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，其含量常用來衡量膜脂過氧化的程度。小黑麥MDA隨著生育期，其含量逐漸增加。同一生育期同一供氮條件下，氮高效小黑麥基因型葉片中MDA含量低于或顯著低于氮低效基因型（表5）。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，在苗期時(shí)，MDA含量較氮低效基因型降低了1.03%，9.52%，35.20%和33.86%；分蘗期除N2供氮條件下，氮高效基因型MDA含量高于氮低效基因型外，其余各供氮條件較氮低效基因型分別降低了17.50%，8.75%和72.41%；拔節(jié)期時(shí)較氮低效基因型降低了18.49%，23.75%，19.48%和15.89%；到最佳刈割時(shí)期——抽穗期較氮低效基因型降低了33.35%，14.99%，24.22%和23.57%。針對(duì)同一生育期同一小黑麥基因型，其MDA含量隨供氮水平的升高而降低。正常供氮條件下，小黑麥氮高效基因型在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時(shí)其MDA含量分別比不施氮條件下降了63.54%，79.41%，43.96%和39.54%；而氮低效基因型，其 MDA 含量分別比不施氮條件下降了45.44%，38.42%，45.70%和30.98%。這表明，在氮高效基因型膜脂過氧化程度較氮低效基因型低，在逆境脅迫下細(xì)胞受傷害較小。

表4 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片CAT活性的影響Table 4 Effects of nitrogen on CAT activity of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency U／（g FW·min）

表5 氮素對(duì)不同氮效率小黑麥基因型葉片MDA含量的影響Table 5 Effects of nitrogen on MDA content of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency μmol／mg FW

2.4 小黑麥葉片保護(hù)酶活性、膜脂過氧化與生物量的相互關(guān)系

小黑麥保護(hù)酶活性及膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量不僅存在顯著的基因型差異，同時(shí)與小黑麥地上部生物量有著密切的相互關(guān)系。小黑麥地上部生物量與葉片中SOD、POD、CAT活性存在的相關(guān)性因生育期不同，而有不同的體現(xiàn)（表6）。在苗期，POD活性與地上部生物量呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系；分蘗期時(shí)，CAT活性與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，到了拔節(jié)期時(shí)其葉片中SOD和CAT活性與地上部生物量達(dá)顯著和極顯著正相關(guān)關(guān)系，而到抽穗期時(shí)，CAT活性與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。除苗期外，MDA含量與地上部生物量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此表明，小黑麥保護(hù)性酶系統(tǒng)中的SOD、POD和CAT是一個(gè)清除活性氧自由基的體系，清除活性氧自由基是其共同作用的結(jié)果，其清除能力也因生育時(shí)期不同各異。由于氮高效基因型SOD、POD、CAT在各生育期具有較高的活性，更能及時(shí)清除活性氧自由基，有效的阻止高濃度氧的積累和膜脂過氧化，降低葉片受損傷程度，提高其光合性能。因此，使其生產(chǎn)出更多的光合產(chǎn)物，增進(jìn)物質(zhì)積累，從而利于其提高氮素利用效率。

3 討論

在植物體內(nèi)存在SOD、POD、CAT等一系列保護(hù)酶，它們能夠在逆境脅迫中維持活性氧的代謝平衡并保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，協(xié)同抵御不良環(huán)境的脅迫，保證植物正常生長(zhǎng)。MDA作為細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物之一，其含量的多少反應(yīng)細(xì)胞受損的程度。因而，通常情況下將抗氧化酶活性和MDA含量視為作物在忍受逆境脅迫的生理指標(biāo)［29］。已有的研究表明［2］，作物葉片中抗氧化酶系統(tǒng)存在品種差異，且其活性高低受到生育期的影響。本試驗(yàn)條件下，不同氮利用效率小黑麥基因型的保護(hù)酶活性存在顯著的基因型差異。除苗期POD活性外，氮高效小黑麥基因型葉片中SOD、POD、CAT活性在各生育期的同一供氮條件下顯著高于氮低效基因型。同時(shí)，其活性隨供氮量增加的幅度大于氮低效基因型。與保護(hù)酶活性相反，氮高效小黑麥基因型葉片膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量在同一生育期同一供氮條件下顯著低于氮低效基因型。針對(duì)同一生育時(shí)期而言，氮高效小黑麥基因型隨供氮量的增加，其細(xì)胞受損害的程度較氮低效基因型明顯降低。由此說明，與氮低效基因型相比，氮高效小黑麥基因型葉片中活性氧清除酶系統(tǒng)能及時(shí)清除活性氧自由基，有效的阻止高濃度氧的積累和膜脂過氧化作用，從而降低葉片的損傷程度，這與相關(guān)學(xué)者對(duì)水稻的研究結(jié)果一致［1］。正常情況下，細(xì)胞自由基活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這些產(chǎn)物的濃度很低不會(huì)引起傷害［2］。但是當(dāng)出現(xiàn)脅迫狀況時(shí)，這一動(dòng)態(tài)平衡就受到破壞，此時(shí)，作物就會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的抗氧化系統(tǒng)來阻止細(xì)胞膜脂過氧化，減弱其受損程度。本研究表明，SOD、POD、CAT活性均能對(duì)地上部生物量產(chǎn)生影響，但其作用大小受生育時(shí)期的影響。表現(xiàn)為，SOD活性大小在拔節(jié)期時(shí)，與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；POD活性大小在苗期時(shí)與地上部生物量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，CAT則在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時(shí)與地上部生物量呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系。由于苗期時(shí)，氮高效基因型地上部生物量在各供氮條件下大于氮低效基因型，說明氮高效小黑麥基因型在苗期時(shí)，其抵抗外界脅迫的能力較強(qiáng)，葉片受損程度相對(duì)較小，所以其POD活性可能就沒有達(dá)到較強(qiáng)值，用于保護(hù)其可能受到的損傷。而對(duì)于氮低效小黑麥基因型，由于其對(duì)氮素吸收和利用的能力較弱，故在苗期時(shí)，就表現(xiàn)出細(xì)胞受到損害的情況，故其清除活性氧自由基的POD酶啟動(dòng)，表現(xiàn)出其活性顯著高于氮高效基因型。因此，這時(shí)表現(xiàn)出POD活性在苗期時(shí)與地上部生物量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。隨著小黑麥的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出SOD、POD、CAT協(xié)同作用，共同清除活性氧自由基，從而降低MDA含量，達(dá)到保護(hù)葉片生理功能，提高產(chǎn)量的作用。

表6 小黑麥葉片保護(hù)酶活性、膜脂過氧化與生物量的相互關(guān)系Table 6 Relationships between biomass of shoot and protective enzyme activities，lipid peroxidation of leaf in Triticale genotypes

4 結(jié)論

氮高效小黑麥基因型（PI429186）在各生育期的同一供氮條件下，其地上部生物量顯著高于氮低效小黑麥基因型（CIxt74）。在同一生育期，小黑麥地上部生物量隨供氮水平的增加而增大，氮高效基因型在正常供氮條件下，其生物量在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期分別較不施氮條件下增加了84.49%，40.49%和40.43%；而氮低效基因型增加了66.87%，29.64%和33.15%，其增產(chǎn)效果小于氮高效基因型。除苗期POD活性在各條件下氮高效小黑麥基因型低于氮低效小黑麥基因型，氮高效基因型小黑麥的SOD、POD、CAT活性在各生育期的同一供氮條件下，其保護(hù)酶活性高于氮低效小黑麥基因型，而MDA含量顯著低于氮低效小黑麥基因型。相關(guān)分析表明，小黑麥地上部生物量與SOD、POD、CAT活性的相關(guān)性因生育期不同其相關(guān)性不一。SOD活性在拔節(jié)期時(shí)與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)，POD活性在苗期時(shí)與地上部生物量呈極顯著負(fù)相關(guān)，CAT則在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時(shí)與地上部生物量呈顯著或極顯著正相關(guān)；而與MDA含量在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時(shí)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。

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