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    兩種策略分別克隆紫花苜蓿光敏色素A、B基因

    2011-06-08 08:22:16李平楊玲玲陳其新史瑩華嚴(yán)學(xué)兵陳占寬王成章
    草業(yè)學(xué)報(bào) 2011年6期

    李平,楊玲玲,陳其新,史瑩華,嚴(yán)學(xué)兵,陳占寬,王成章*

    (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450002;2.河南省農(nóng)作物新品種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州450001)

    紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界公認(rèn)的一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草,被譽(yù)為“牧草之王”[1],其在我國草產(chǎn)業(yè)中的重要性日益凸現(xiàn)[2],苜蓿產(chǎn)業(yè)也正逐步發(fā)展成為我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的新興產(chǎn)業(yè)[3]。苜蓿的秋眠性(fall dormancy,F(xiàn)D)是苜蓿在秋季日照長度變短和氣溫下降時(shí)的一種適應(yīng)性生長特性[4,5]。研究表明,苜蓿的秋眠性與抗寒性[6,7]、生產(chǎn)性能[8-12]等相關(guān),因此,很多國家都將其作為苜蓿栽培選擇品種時(shí)的首要指標(biāo)[7],也成為苜蓿研究中的熱點(diǎn)和重要參考性狀[13,14]。盡管對苜蓿秋眠性的機(jī)理尚存爭議,但目前被廣泛接受的觀點(diǎn)為苜蓿秋眠是一種光周期反應(yīng)(photoperiod response)[4,5,7],不同秋眠型苜蓿品種對光周期反應(yīng)的差異與它們原產(chǎn)地生長季節(jié)的自然日照長度有很大關(guān)系,是植物對環(huán)境條件長期適應(yīng)的結(jié)果。因此,從光周期角度研究光受體與苜蓿秋眠性的關(guān)系可能是揭示苜蓿秋眠性機(jī)理的有效途徑之一。

    植物接收光周期信號主要是通過光受體(photoreceptor)來實(shí)現(xiàn)的。通過光受體,光才能與植物內(nèi)源的發(fā)育程序相互作用,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[15]。目前,已知至少存在4類感受不同波長的光受體:光敏色素(phytochrome,PHY),主要感受紅光(620~700nm)和遠(yuǎn)紅光(700~800nm);隱花色素(cryptochrome,CRY)和向光素(phototropin,PHOT,也稱作NPH1),感受藍(lán)光(380~500nm)和近紫外光 (UV-A,320~380nm);一個(gè)或幾個(gè)尚未鑒定的紫外光B(UV-B)受體,感受紫外光B區(qū)域(280~320nm)的光[16]。光敏色素是植物體內(nèi)最重要也是目前研究最為深入的一類光受體[17],它們的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是植物光形態(tài)建成研究的里程碑[18]。光敏色素是一個(gè)較為復(fù)雜的基因家族,擬南芥(Arabidopsisthaliana)PHY家族至少包括5個(gè)執(zhí)行不同生理功能的成員(PHYA,PHYB,PHYC,PHYD,PHYE),其中尤以PHYA、PHYB研究最為深入[19]。

    采用酶聯(lián)免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)研究了3個(gè)不同秋眠型苜蓿品種在8,12和16h光照條件下葉片和頂芽中的PHYB含量。結(jié)果表明,3個(gè)品種均是在8h光照下PHYB合成量高,而且秋眠型比非秋眠型苜蓿葉片中PHYB含量高。由此推測,PHYB作為綠色植物主要光受體,可能通過光周期(短日照)參與苜蓿秋眠的調(diào)控[20,21]。另外,PHYA也是一種重要的光敏色素,已有研究證實(shí)PHYA與PHYB共同參與了植物的多種生理反應(yīng)[22-24],因此,推測PHYA也可能參與苜蓿秋眠的調(diào)控。

    利用模式物種已知基因信息資源克隆近緣物種未知基因是一種常用而且高效的方法。紫花苜蓿雖是非常重要的豆科牧草,但其已經(jīng)測定的基因資源卻非常有限。幸運(yùn)的是,與紫花苜蓿同屬的蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)是一種即將完成全基因組序列測定的豆科模式植物,具有大量的基因信息資源(www.medicago.org),兩者具有非常近的親緣關(guān)系[比其他豆科模式物種如豌豆(Pisumsativum)、百脈根(Lotuscorniculatus)、大豆(Glycinemax)親緣關(guān)系更近],兩者二倍體的染色體數(shù)相同且基因具有高度的共線性,基因組具有非常高的同源性[25-28],例如幾丁質(zhì)酶基因在氨基酸水平同源性達(dá)到98%[29]。因此,對于欲研究的未知紫花苜?;?,可以通過預(yù)測或查找蒺藜苜蓿相關(guān)基因,然后將其近似假定為未知的紫花苜?;蚝妥钪匾獏⒖夹蛄校僖灾鳛槟0逶O(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng),從而直接克隆得到紫花苜蓿基因序列。這種策略將“未知基因”變成“已知基因(近似基因)”,引物為特異引物而非簡并引物,僅需普通PCR反應(yīng)即可得到基因部分或全長序列,因而將是克隆紫花苜蓿未知基因的一條捷徑。

    目前,紫花苜蓿的PHYA和PHYB基因都尚未被克隆。本研究采用2種不同的策略對紫花苜蓿PHYA和PHYB基因進(jìn)行了克隆。其中,PHYA采用較為常用的方法,以mRNA為起點(diǎn),運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和cDNA 末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)獲得PHYAcDNA主體序列,輔以染色體步移法獲得PHYA5′端序列;PHYB則根據(jù)比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的有關(guān)原理,首先預(yù)測蒺藜苜蓿PHYB基因,然后以預(yù)測的蒺藜苜蓿PHYB基因序列設(shè)計(jì)引物直接擴(kuò)增得到紫花苜蓿PHYB基因主體序列,再使用染色體步移法得到該基因的5′端序列。本研究最終獲得PHYA的cDNA基因全長和PHYB基因的近全長序列,為進(jìn)一步利用分子生物學(xué)手段探究這2種光敏色素基因在苜蓿秋眠性調(diào)控機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)材料 2007年7月,將紫花苜蓿品種 WL-525HQ盆栽于實(shí)驗(yàn)室,根據(jù)試驗(yàn)需要隨時(shí)摘取其莖端葉片提取總RNA和基因組DNA。

    1.1.2 主要試劑 快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)(目錄號:DP321)、DNA凝膠回收試劑盒(目錄號:DP209)、質(zhì)粒抽提純化試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司;總RNA提取試劑(RNAiso Plus,目錄號:D9108A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(目錄號:DRR023)、3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒、5′-Full RACE Kit試劑盒、染色體步移試劑盒(genome walking kit,目錄號:D316)、LA Taq(目錄號:DRR02)、pMD19-T載體(目錄號:D102)、感受態(tài)細(xì)胞JM109(目錄號:D9052)、DNA Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR引物合成和測序主要由北京三博遠(yuǎn)志技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司和寶生物工程(大連)有限公司完成。

    1.1.3 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中發(fā)表的有關(guān)基因序列,使用Oligo(Version 6.54)軟件設(shè)計(jì)引物。

    1.2 RNA和DNA的提取

    1.2.1 植物總RNA的提取 將約25mg新鮮的紫花苜蓿莖頂端葉片迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中研磨至粉狀,按照RNA提取試劑盒(Takara,RNAiso Plus)的操作說明提取總RNA。

    1.2.2 植物基因組DNA的提取 取紫花苜蓿莖頂端新鮮葉片約100mg在液氮中研磨至粉狀,之后按試劑盒(天根快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng))說明書進(jìn)行操作。

    1.3 紫花苜蓿PHYA基因的克隆

    1.3.1 紫花苜蓿PHYAmRNA基因片段的克隆 因?yàn)槟壳吧袩o有關(guān)紫花苜蓿PHYA基因序列的報(bào)道,因而,本研究根據(jù)GenBank已發(fā)表的與苜蓿親緣關(guān)系較近的其他豆科植物(主要參考大豆和豌豆)的PHYA基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對PCR引物,序列為,F(xiàn)1:TTGGGGTTTGGTAGTTTGCCAT;R1:AGCCTTGAATGATGATCTTG GATGC。反轉(zhuǎn)錄用Random 9mers作引物,反應(yīng)條件:65℃1min,30℃5min,25min勻速升溫至65℃,然后65℃20min,98℃5min,5℃5min。PCR擴(kuò)增按照94℃5min;94℃30s,60℃30s,72℃45s,30個(gè)循環(huán);72℃5min進(jìn)行。對擴(kuò)增產(chǎn)物先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后用凝膠純化回收試劑盒回收預(yù)期的目的DNA片段,委托北京三博遠(yuǎn)志技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。

    1.3.2 紫花苜蓿PHYA3′RACE 采用3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒。根據(jù)獲得的PHYA基因片段序列,設(shè)計(jì)3′RACE套式PCR特異性引物,Outer和Inner引物序列分別為:3OTGTGCGATATGCTGATGCGAGAT,3IAGATAAGAGAGATAGCTTTATGGATGTCCGAG。具體操作基本按照試劑盒說明書進(jìn)行,其中,反轉(zhuǎn)錄體系為10μL,反應(yīng)條件為42℃60min,70℃15min;套式PCR Outer反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。之后取Outer PCR產(chǎn)物1μL作為模板進(jìn)行Inner反應(yīng),條件為:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,割膠回收目的片段,再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序。

    1.3.3 紫花苜蓿PHYA5′RACE 采用5′-Full RACE Kit試劑盒。根據(jù)獲得的PHYA基因片段序列,設(shè)計(jì)5′RACE套式PCR特異性引物,Outer和Inner引物序列分別為:5OACAGCTGCCATTCCACATACAGT,5I CGTCGAT CCTAATATCCATAACTTG。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。主要步驟包括去磷酸化處理、“去帽子”反應(yīng)、5′RACE Adaptor的連接、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、Outer PCR反應(yīng)和Inner PCR反應(yīng)。其中 Outer PCR反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃150s,20個(gè)循環(huán);72℃10min。Inner PCR反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃150s,25個(gè)循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離、回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序。

    1.3.4 紫花苜蓿PHYA5′端染色體步移 將以上克隆得到的3個(gè)PHYA序列片段,通過拼接和分析比對后發(fā)現(xiàn)5′RACE并未得到5′端cDNA全長,而是缺失了約367bp的編碼(coding sequence,CDS)序列,重復(fù)1次試驗(yàn)后仍未得到理想結(jié)果,于是改用染色體步移法獲得5′端缺失的CDS序列。引物設(shè)計(jì)模板為上述克隆拼接得到的cDNA序列,第1,2,3輪特異引物分別為 A53CACTATCTCCATCTTCATCGCTGTC、A52GGGA ATATCTGTGGCCGGATAGTG和A51CGGTAACACGGTGAATAATCGCAT。具體操作按照染色體步移試劑盒(genome walking kit)說明書進(jìn)行,其中,以 WL-525HQ基因組DNA為模板,以試劑盒提供的 AP引物1,2,3,4作為上游引物分別與3輪特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng),延伸時(shí)間為2min。3輪反應(yīng)后,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,將效果最好(條帶亮、單一)的AP引物1與A51引物組合的第3輪PCR產(chǎn)物分離、克隆和測序。

    1.4 紫花苜蓿PHYB基因的克隆

    通過預(yù)測與紫花苜蓿同屬的蒺藜苜蓿的PHYB基因,然后以其為參考序列,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng),從而直接克隆得到紫花苜蓿PHYB基因序列。

    1.4.1 蒺藜苜蓿PHYB基因預(yù)測 在通過與幾種近緣物種已測序PHYB基因的反復(fù)比對及在GenBank非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫中使用Blastn搜索后,發(fā)現(xiàn)在登錄號為AC152185的蒺藜苜蓿細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)克隆測序結(jié)果中,在第25 551~32 007位堿基,有1段長度為6 457bp的序列,注釋為“GAF;heavy metal sensor kinase”基因(尚無中文翻譯,可暫譯為“重金屬感受器激酶”),編碼蛋白登錄號為:ABN07956.1,全長1 152個(gè)氨基酸。經(jīng)查,光敏色素基因中包含GAF區(qū)(GAF domain)。這段序列與豌豆、大豆和百脈根的PHYB基因高度相似且長度、結(jié)構(gòu)都非常吻合,將此段序列通過Blastx比對后,推測該段序列極可能為蒺藜苜蓿的PHYB基因,而并非注釋的“GAF;heavy metal sensor kinase”基因(盡管光敏色素中包含GAF區(qū),但并不能用GAF代表整個(gè)基因),經(jīng)與其他物種PHYB基因序列比對分析后可知該序列方向與mRNA序列相反,應(yīng)為mRNA序列的反向互補(bǔ)序列。為進(jìn)一步驗(yàn)證其可靠性,將該序列用FASTA-Protein程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/fasta33/)進(jìn)行比對,得到與Blastp非常近似的結(jié)果,即:該段序列所編碼的氨基酸序列與以下幾種植物的PHYB相似性很高,由高到低依次為:豌豆(93%)、百脈根(88%)、大豆(87%)和葡萄(Vitis vinifera)(80%)(后略),由注釋信息可知,該基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因注釋的外顯子與內(nèi)含子邊界的正確性,采取了3種驗(yàn)證方式:1)通過GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)在線服務(wù)分析,Organism選擇“擬南芥”(玉米預(yù)測效果較差),對比發(fā)現(xiàn)前3個(gè)外顯子與“GAF;heavy metal sensor kinase”注釋相一致,而最后1個(gè)外顯子不符。2)對后段GENSCAN預(yù)測不準(zhǔn)區(qū)域通過氨基酸序列tBlastn查找最后1個(gè)外顯子在核苷酸序列中相應(yīng)的位置。3)應(yīng)用GT-AG規(guī)則對整個(gè)基因的外顯子-內(nèi)含子邊界進(jìn)行驗(yàn)證。通過驗(yàn)證,認(rèn)為在GenBank中登錄號為AC152185、名為“GAF;heavy metal sensor kinase”的基因,實(shí)際上應(yīng)為PHYB基因,而其關(guān)于基因長度及內(nèi)含子、外顯子邊界等相關(guān)注釋是可信的,于是得到預(yù)測的蒺藜苜蓿PHYB基因的CDS(3 459bp)和包含了內(nèi)含子的基因組序列(6 457bp)。

    1.4.2 紫花苜蓿PHYB基因主體序列的克隆 直接以預(yù)測的蒺藜苜蓿PHYB基因CDS序列為模板,設(shè)計(jì)了2對能部分重疊的PCR引物(因基因較長,采用分段克隆再拼接的策略),分別為:LU1CCTGAACAACAGATCACT GCTTAC、17UCAAGCACCTCTTCTCCCACC 和 HU1TTCAGTTAGCCGCACAGTCGTT 與 HL2 CTTCTCC GCGTCACAGGTAGTTC?;蚪MDNA提取見1.2.2(下同)。LU1與17U組合的PCR反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃90s,35個(gè)循環(huán);72℃5min。HU1與 HL2組合的PCR反應(yīng)條件為:94℃1min;98℃10s,68℃6min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。目的產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆和測序。

    1.4.3 紫花苜蓿PHYB5′端染色體步移 通過對上述1.4.2中獲得的序列進(jìn)行拼接,得到了紫花苜蓿PHYB的主體序列,3′端與預(yù)測的蒺藜苜蓿PHYB相差僅19bp,而5′端相差約300bp,為給下游試驗(yàn)提供盡量長的序列信息和獲得可能的PHYB啟動子序列,使用染色體步移法對PHYB5′端序列進(jìn)行克隆。引物設(shè)計(jì)模板為上述1.4.2中克隆拼接得到的CDS序列,第1,2,3輪特異引物分別為B52TGACAACCATGAGGAGCACGAAGCG、B53AACCTCGACGCCTGCGGTATATCAGT和B54CCCATATACGGCTCCAAATCAATC。其余操作同1.3.4,將效果最好的AP4引物第3輪PCR產(chǎn)物克隆和測序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 獲得紫花苜蓿PHYA基因cDNA全長序列

    使用引物F1和R1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期擴(kuò)增長度相符的約570bp的cDNA片段(圖1)。測序后獲得了長度為549bp的cDNA片段,Blast比對結(jié)果證實(shí)這個(gè)cDNA片段與其他已克隆的PHYA基因具有很高的相似性,說明是PHYA基因片段的序列。根據(jù)此片段設(shè)計(jì)特異引物3O和3I、5O和5I,用RACE技術(shù)擴(kuò)增到此基因的5′和3′末端序列(圖2和3)。將這3個(gè)片段的序列進(jìn)行拼接,得到長度為3 130bp(GenBank登錄號為GQ379905)的PHYA基因序列。而后,使用染色體步移法克隆得到了1 260bp的5′端序列(圖4)(Gen-Bank登錄號為GQ379904),補(bǔ)齊了此前缺失的5′端序列。再經(jīng)過分析比對和拼接剪切,得到了紫花苜蓿PHYACDS全長,共3 375bp,編碼1 125個(gè)氨基酸。經(jīng)分析,紫花苜蓿PHYA基因與已知的GenBank中的植物PHYA基因的相似性都比較高(大多在75%以上),與豌豆、百脈根、山黧豆(Lathyrussativus)等豆科植物都達(dá)到92%以上。

    圖1 PHYART-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PHYART-PCR amplification

    圖2 PHYA3′RACE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PHYA3′RACE-PCR amplification

    2.2 獲得紫花苜蓿PHYB基因組DNA近全長序列

    圖3 PHYA5′RACE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PHYA5′RACE-PCR amplification

    圖4 PHYAgenome walking擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 PHYAgenome walking amplification

    圖5 PHYBPCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5 PHYBPCR amplification

    使用2對引物L(fēng)U1、17U和HU1、HL2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別得到與預(yù)期擴(kuò)增片段相符的2個(gè)片段(圖5和6)。測序結(jié)果表明,兩片段長度分別為1 097和4 997bp。染色體步移獲得了1 752bp的5′端序列(圖7)。將3段序列拼接后得到長度為7 150bp的基因序列(登錄號 GQ379902),其中包含了5′端非翻譯區(qū)(UTR)、3個(gè)內(nèi)含子和長度為3 425bp的CDS序列(編碼1 141個(gè)氨基酸),達(dá)到預(yù)測的蒺藜苜蓿PHYB基因編碼序列的99.0%。將紫花苜蓿PHYBCDS序列與編碼氨基酸序列分別進(jìn)行Blastn和Blastp,得到的相似性由高到低分別為:蒺藜苜蓿預(yù)測PHYB(97%)、豌豆PHYB(91%)、大豆PHYB(86%)和百脈根PHYB(85%);蒺藜苜蓿預(yù)測PHYB(97%)、豌豆PHYB(93%)、百脈根PHYB(89%)和大豆PHYB(88%)。

    圖7 PHYBgenome walking擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.7 PHYBgenome walking amplification

    分析發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿PHYB與預(yù)測的蒺藜苜蓿PHYB,不僅基因結(jié)構(gòu)及其保守區(qū)序列十分相似,并且在非編碼區(qū)的基因序列相似性也很高。紫花苜蓿PHYB5′端上游長度為886bp的序列與預(yù)測的蒺藜苜蓿PHYB5′端上游序列相似性達(dá)到78%,一致性(Identities)=630/804,兩者內(nèi)含子序列相似性也接近90%。非編碼區(qū)具有這樣高的序列相似性,說明可以嘗試在蒺藜苜蓿已知或預(yù)測基因的CDS外端設(shè)計(jì)引物,這樣會使引物設(shè)計(jì)的范圍拓寬,就可能直接克隆出未知紫花苜?;虻娜L,從而省去RACE和染色體步移等操作,大大提高試驗(yàn)效率,節(jié)約試驗(yàn)成本。

    3 討論

    本研究采用了2種基因克隆策略分別克隆紫花苜蓿PHYA和PHYB基因,現(xiàn)對兩者進(jìn)行比較:1)PHYA和PHYB分別以mRNA和基因組DNA為試驗(yàn)起點(diǎn),前者由于mRNA容易降解,因此對操作和試驗(yàn)條件要求較高,而且進(jìn)行PCR前需要反轉(zhuǎn)錄;后者可獲得內(nèi)含子等更多基因信息,但內(nèi)含子較大時(shí)也會增大克隆難度和測序成本。2)對于PHYA,先根據(jù)近緣物種已知PHYA基因序列在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物RT-PCR擴(kuò)增出一段序列,然后用3′RACE和5′RACE向兩端延伸;對于PHYB,先預(yù)測蒺藜苜蓿PHYB,然后直接以之設(shè)計(jì)PCR引物克隆得到紫花苜蓿PHYB的大部分序列,最后再用染色體步移法補(bǔ)齊5′端序列。兩者所采用的RACE和染色體步移法,盡管原理不同[30,31],試驗(yàn)起點(diǎn)不同,但都是根據(jù)已知序列片段向兩側(cè)延伸從而克隆未知區(qū)域序列的常用方法[32-34]。其中PHYA5′RACE未得到理想的結(jié)果(獲得5′cDNA全長),原因可能是多方面的,包括操作步驟較多、試驗(yàn)條件要求高、試劑較為昂貴等[35];而染色體步移法操作較為簡單,試驗(yàn)條件要求較低,試驗(yàn)成功率高,試劑成本較低,所以可優(yōu)先作為克隆基因未知區(qū)域序列的方法。3)2種策略的本質(zhì)差別在于前者只是按照克隆未知基因的一般思路和模式,后者則是充分利用蒺藜苜蓿與紫花苜蓿基因組的高度相似性,將“未知”變成“已知”,將未知基因的克隆變成了“已知(或準(zhǔn)已知)”基因的克隆,這樣,無論采用mRNA還是基因組DNA為試驗(yàn)起點(diǎn),都可以通過查找或預(yù)測蒺藜苜蓿對應(yīng)基因,然后直接應(yīng)用或作為最重要的參考序列來克隆紫花苜蓿目的基因,這樣往往會使克隆難度大大降低,從而快速高效的完成試驗(yàn);但后者對試驗(yàn)人員的理論基礎(chǔ)、生物信息學(xué)操作和分析能力要求較高,前期需要進(jìn)行細(xì)致的分析和基因預(yù)測等工作。所以,針對特定的試驗(yàn)條件、目的和研究背景,2種策略各有優(yōu)劣。綜上所述,當(dāng)前紫花苜?;蛐畔①Y源短缺,卻擁有大量可以利用的蒺藜苜?;蛐畔①Y源,在這種情況下,應(yīng)充分利用蒺藜苜蓿資源研究紫花苜蓿,這非常適用于紫花苜蓿未知基因的克隆,同理,也適用于紫花苜蓿研究的其他很多方面[36],例如用于蒺藜苜蓿的基因芯片同樣可適用于紫花苜蓿[37]等,因此,在進(jìn)行某些紫花苜蓿相關(guān)研究時(shí),可以先對蒺藜苜蓿進(jìn)行研究,而后再應(yīng)用于紫花苜蓿,可能繞道蒺藜苜蓿后,反而加快了研究進(jìn)程。

    植物接受環(huán)境中光信號并調(diào)節(jié)自身生理反應(yīng)的機(jī)制是非常復(fù)雜的,常常有多種光受體共同參與和調(diào)控[24,38,39],例如隱花色素和光敏色素一起調(diào)節(jié)植物的去黃化反應(yīng)、光周期反應(yīng)和光形態(tài)建成反應(yīng)[15,18,22]。因此,欲探究光與苜蓿秋眠性的關(guān)系,除了光敏色素中的PHYA、PHYB外,還應(yīng)將其他可能存在的光敏色素以及隱花色素、向光素甚至紫外光受體等其他光受體列入研究范圍。

    本試驗(yàn)使用2種策略克隆了紫花苜蓿PHYA和PHYB基因,所得序列均可以滿足下游實(shí)時(shí)定量PCR(Realtime PCR)和RNA干擾(RNAi)試驗(yàn)要求,為進(jìn)一步研究兩基因的功能及其與苜蓿秋眠的關(guān)系奠定了基礎(chǔ);同時(shí)證明利用豆科模式植物蒺藜苜蓿已知基因組信息資源克隆紫花苜蓿未知基因的方法是可行和高效的,從而為克隆紫花苜蓿其他未知基因及其他方面研究提供思路和參考。

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