菊苣航天誘變材料RAPD分析及高產(chǎn)品系篩選

韓永芬，盧欣石，舒健虹，付薇，陸瑞霞，覃濤英

（1.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院草業(yè)科學(xué)，北京100083；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽550006）

菊苣（Cichoriumintybus）為多年生草本植物，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的飼用牧草，原產(chǎn)于地中海、中亞和北非。菊苣在國(guó)外主要用于蔬菜和制糖原料及咖啡代用品。目前，我國(guó)登記了2個(gè)菊苣品種普那菊苣、將軍菊苣，均為引進(jìn)品種。普那菊苣（Cichoriumintybuscv.Puna）是20世紀(jì)80年代新西蘭科工部草地研究所培育出的菊苣飼用新品種，1985年正式鑒定通過并推廣利用［1］，貴州省草業(yè)研究所1997年從新西蘭引進(jìn)種植，通過引種馴化，并對(duì)其進(jìn)行選育研究，于2005年9月通過貴州省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定命名為黔引普那菊苣，現(xiàn)已在生產(chǎn)中大量推廣應(yīng)用。

Damato［2］1991－1993年研究了播種期、種植密度對(duì)菊苣種子產(chǎn)量的影響，研究結(jié)果表明，意大利半島11月或3月播種，密度以11.1株／m2效果較好，種子產(chǎn)量可達(dá)639kg／hm2。新西蘭Hume等［3］1986－1995年對(duì)利用普那菊苣建植的混播草地進(jìn)行了綿羊放牧利用研究，設(shè)計(jì)了不同混播組合、放牧頻率、利用年限等，在4年內(nèi)混播草地中普那菊苣所提供產(chǎn)草量在第1～3年增加，第4年減少，提供干物質(zhì)占混播草地的34%，80%，85% 和57%，普那菊苣、高羊茅（Festucaarundinacea）、大網(wǎng)茅草（Bromuswillednowii，prairie grass）混播是比較好的組合。Boyd和Rogers［4］1997－2003年對(duì)普那菊苣的耐鹽性進(jìn)行了研究，認(rèn)為在200mmol／L NaCl濃度下，仍生長(zhǎng)良好。國(guó)內(nèi)主要是在引種的基礎(chǔ)上開展相關(guān)研究，熊先勤等［5］研究了菊苣的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，韓永芬等［6］對(duì)普那菊苣高產(chǎn)配套栽培技術(shù)、不同刈割利用方式進(jìn)行了研究，左相兵等［7，8］對(duì)飼喂肉兔、三元雜交豬進(jìn)行了試驗(yàn)，劉鳳霞等［9］對(duì)菊苣種子生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行了研究，孫變姿等［10］對(duì)菊苣葉提取物對(duì)粘蟲的生物活性進(jìn)行了研究，研究對(duì)象均為引進(jìn)品種，沒有具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種。

在菊苣遺傳多樣性研究方面國(guó)外有部分相關(guān)報(bào)道，Van Cutsem等［11］采用擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記對(duì)菊苣野生種和栽培種之間的基因流動(dòng)進(jìn)行了研究；Baes和Van Cutsem［12，13］用同工酶，Kiers等［14］及Koch和Jung［15］用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）和AFLP標(biāo)記說明菊苣栽培種中存在著豐富的遺傳多樣性；國(guó)內(nèi)，羅燕等［16］利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同地理類群的菊苣材料進(jìn)行了研究，相同或相似地理來源和氣候類型的材料能基本聚在一起，說明遺傳多樣性與地理來源和氣候類型有一定的關(guān)系，而在菊苣誘變材料之間的研究沒見相關(guān)報(bào)道。

航天誘變?cè)谲俎＃∕edicagosativa）、紅豆草（Onobrychistaneitica）、沙打旺（Astragalusadsurgens）等豆科牧草上有所應(yīng)用，并表現(xiàn)出較好的誘變效果［17］。該研究通過對(duì)2006年實(shí)踐八號(hào)育種衛(wèi)星搭載返回的黔引普那菊苣種子為選育材料，經(jīng)幾代選育后培育出的新品系進(jìn)行形態(tài)特征比較、RAPD分析及生產(chǎn)性能研究，創(chuàng)造出生產(chǎn)性能好具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品系，彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)菊苣依賴進(jìn)口，缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的空白，為菊苣新品種選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

同時(shí)種植2006年航天搭載的黔引普那菊苣材料和地面對(duì)照種子，篩選優(yōu)良的突變材料。SP1代生長(zhǎng)期間調(diào)查出苗率、存活率、株高、花序長(zhǎng)、畸變株率和不育株率等，并與對(duì)照植株進(jìn)行比較，淘汰白化苗、畸變株等。其余正常株孕蕾后套袋，單株收種，將每序脫粒混合起來，用作為SP2代的篩選材料。生長(zhǎng)期間在群體中進(jìn)行觀察調(diào)查，以發(fā)現(xiàn)有利變異植株。收獲前再根據(jù)育種目標(biāo)對(duì)入選脫粒時(shí)結(jié)合考種，淘汰性狀不良的單序，并分單株進(jìn)行篩選，入選單株分別收獲脫粒，分別裝代編號(hào)，作為播種SP3代的材料，目前選育到SP4代，獲變異材料27份，現(xiàn)表現(xiàn)較穩(wěn)定，另加上PA－57（黔引普那菊苣）和PA－36（將軍），共計(jì)材料29份。試驗(yàn)材料于2009年9月12日種植于貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山試驗(yàn)基地，取樣進(jìn)行RAPD分析的時(shí)間為2010年3月4日。

1.2 誘變品系的RAPD分析

1.2.1 DNA的提取 采用寶生物工程（大連）有限公司（TakaRa）植物基因組DNA提取試劑盒。

1.2.2 引物的篩選及反應(yīng)體系 選2個(gè)DNA樣品作模板，對(duì)賽百勝公司的100個(gè)RAPD引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，從中選取了15個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物，在29個(gè)種質(zhì)之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積為25μL，內(nèi)含10×buffer，MgCl21.5mmol／L，dNTPs 150μmol／L，TaqDNA聚合酶0.5U，引物1μmol／L，模板30ng，在BIO－RAD公司生產(chǎn)的 MyCyclerTMPCR儀上進(jìn)行如下程序：92℃3min；92℃1min；35℃1min；72℃2min，循環(huán)45次；72℃延伸8min。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 用1×TBE緩沖液配制1.2%（W／V）的瓊脂糖凝膠，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，在每個(gè)樣品中加入4μL電泳指示液（溴酚藍(lán)0.25%，蔗糖40%）混勻，每個(gè)泳道上樣22μL，選擇合適的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記（如1 000，750，500bp），在180V電泳2～3h，將凝膠浸于0.5μg／mL的EB溶液中染30～60min，用水清洗凝膠（約10min），在BioSensSC810系列凝膠成像系統(tǒng)上觀察，拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì) RAPD為顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性。將PCR擴(kuò)增的DNA電泳條帶作為位點(diǎn)記錄下來，若某個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物在一個(gè)樣品中出現(xiàn)，記作“1”，未出現(xiàn)的記作“0”。原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件，利用NTSYS－pc計(jì)算遺傳相似系數(shù)（DICE系數(shù)），并且進(jìn)行非加權(quán)組平均法（UPGMA，unweighted pair－group method with arithmetic means）聚類分析。

1.3 誘變品系的形態(tài)特征及生產(chǎn)性能研究

于2009年9月12日將29個(gè)品系種植于貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山試驗(yàn)基地，4個(gè)重復(fù)，小區(qū)面積6m2，在蓮座期每小區(qū)取10株共40株觀察葉形、葉色（用草坪比色卡進(jìn)行分級(jí)）、葉脈，并測(cè)量葉長(zhǎng)和葉寬等。4個(gè)重復(fù)中留1個(gè)重復(fù)用于后期的生長(zhǎng)觀察，另3個(gè)重復(fù)用于鮮草產(chǎn)量測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣RAPD多態(tài)性

15個(gè)RAPD隨機(jī)引物在供試材料中共擴(kuò)增出78條帶，擴(kuò)增片斷大小從100bp到2 000bp（圖1），其中63條具有多態(tài)性，總的多態(tài)性條帶比率PPB（number of polymorphic bands）為87.77%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.2條帶（表1）。進(jìn)一步比較各個(gè)引物的PPB值，有9個(gè)引物的多態(tài)性條帶比率在80.00%以上，其中引物SA10、SB2、SC3、SC4、SC10、SC13的多態(tài)性比率達(dá)100%。

2.2 菊苣遺傳相似系數(shù)

將擴(kuò)增所得到的78條片段在NTSYS－pc下計(jì)算材料間的遺傳相似系數(shù)（GS值）（表1）。GS值的變化范圍為0.60～0.91。基于遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析，在聚類圖（圖2）上品系PA－186單成1支，與其他材料之間的相似性較低；剩下的28份菊苣材料的相似性較高，集中為0.69～0.80，其中PA－51、PA－46又各單成1支，與其他材料之間的相似性較低。所選的29份菊苣材料中相似性最高的是PA－92和PA－26，相似性系數(shù)高達(dá)0.91，相似性最低的是PA－196和PA－18，PA－43和PA－41，兩者之間的相似系數(shù)為0.60。

如果以0.74為參照值，29份菊苣材料可以分為6個(gè)類群，PA－57、PA－62、PA－92、PA－26、PA－52、PA－89、PA－36、PA－11、PA－93、PA－33為 1 個(gè) 類 群；PA－45、PA－95、PA－18、PA－14、PA－42、PA－23、PA－31、PA－96、PA－54、PA－82、PA－85、PA－49、PA－43、PA－8為1個(gè)類群；PA－20、PA－41為1個(gè)類群；PA－51為1個(gè)類群；PA－46為1個(gè)類群；PA－186為1個(gè)類群。

圖1 引物SE18對(duì)菊苣擴(kuò)增的RAPD圖譜Fig.1 RAPD fingerprint of C.intybus with primer SE18

表1 引物、序列和擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Primers，sequences and amplified results

圖2 29份菊苣材料的RAPD聚類分析樹狀圖Fig.2 UPGMA dendrogram for C.intybus based on Nei－Li’s genetic similarity coefficients

2.3 形態(tài)特征變化

黔引普那菊苣葉片為披針形，突變后形態(tài)特征發(fā)生變化，出現(xiàn)橢圓形、羽狀及披針形葉。并且有葉色變淺、葉色變深、葉片變薄、葉片變厚、葉脈出現(xiàn)紫紅色等現(xiàn)象，其部分特征特性見表2，差異顯著性檢驗(yàn)見表3。

表2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Table 2 Observation results of morphologic chatacteristic

續(xù)表2 Continued

表3 供試的29個(gè)菊苣品系生產(chǎn)性能Table 3 Production performance of 29 C.intybus provided in experiment

2.4 菊苣新品系牧草生產(chǎn)性能

參試29個(gè)菊苣品系在株高40cm時(shí)刈割，其年產(chǎn)草量結(jié)果見表3，經(jīng)方差分析，產(chǎn)量差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），產(chǎn)量高于目前主推品種黔引普那菊苣和將軍的品系有PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82、PA－54、PA－96。

采用離差平方和法對(duì)29個(gè)菊苣材料進(jìn)行聚類（圖3），PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82為第1類群，產(chǎn)量較高；PA－54、PA－57、PA－36、PA－96、PA－26、PA－8、PA－89、PA－45為第2類群，產(chǎn)量中等；PA－92、PA－14、PA－85、PA－52、PA－46、PA－41、PA－33、PA－51、PA－62、PA－23、PA－18為第3類群，產(chǎn)量較低。

圖3 29個(gè)菊苣品系產(chǎn)量聚類圖Fig.3 Production dendrogram for 29 C.intybus strains

3 討論與結(jié)論

從RAPD聚類結(jié)果和表型特征來看，相似性最高的2份材料PA－92和PA－26，兩者找不到明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從外型看，一個(gè)為羽狀葉，一個(gè)葉片為披針型，只有葉脈綠色這一共同點(diǎn)。相似性較低的PA－186和PA－18在葉型上基本一致，均為披針形，但葉脈顏色不同，一個(gè)為綠色，一個(gè)為紫色。而PA－43和PA－41相似性較低，從外型上看也明顯不一致，一個(gè)為披針形葉，一個(gè)為羽狀葉。但在第1類群中，從葉型上看，除PA－26以外，其余材料均為披針形葉，葉脈顏色以綠色為主。以前的研究表明RAPD方法得到的聚類圖可以反映品種的親本特征及育種歷史，但是聚類結(jié)果與表型特征相關(guān)性卻較差［18］，對(duì)聚類結(jié)果與表型特征不完全一致這一現(xiàn)象，該研究有與之相類似的結(jié)論。

從菊苣牧草生產(chǎn)性能聚類結(jié)果看，產(chǎn)量高于目前主推品種黔引普那菊苣和將軍的品系有PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82、PA－57、PA－96共12個(gè)，且葉型集中為披針形葉和橢圓形葉。有PA－49、PA－11、PA－42、PA－95、PA－82、PA－93、PA－20等7個(gè)品系既高產(chǎn)又抗旱［19］，抗旱材料多數(shù)集中在RAPD聚類結(jié)果中的第2類群。對(duì)高產(chǎn)抗逆菊苣新品種選育具有非常重要的實(shí)際意義。

在生產(chǎn)利用中建植高產(chǎn)持久性人工草地時(shí)為了得到均一的形態(tài)外觀，要求所選用品種的形態(tài)特征盡可能一致，但是，同時(shí)為了提高其抵抗外界生物及非生物脅迫的能力，則品種之間要求有較高的遺傳多樣性。在檢測(cè)的29份菊苣材料中，形態(tài)特征較一致而相似性系數(shù)較低的材料，如PA－93、PA－82都是披針形葉，葉色深綠達(dá)9級(jí)，有絨毛，葉脈綠色，且比較抗旱、高產(chǎn)，所以適合一起混播建植人工草地。

菊苣作為一種引進(jìn)牧草品種，國(guó)內(nèi)資源稀有，雖有對(duì)不同品種及地域的種質(zhì)資源進(jìn)行分析研究的相關(guān)報(bào)道［11－16］，但從總的來說，研究相對(duì)于其他牧草［20］還有差距，目前所獲得有關(guān)菊苣遺傳多樣性的信息相對(duì)很少，該內(nèi)容為菊苣研究提供了較為豐富的種質(zhì)資源，且這樣的信息對(duì)于構(gòu)建分子遺傳圖譜的作圖群體及明確種質(zhì)資源收集和利用目標(biāo)非常重要。所以，在今后的研究中，應(yīng)該通過分子標(biāo)記建立菊苣分子遺傳圖譜，并加強(qiáng)對(duì)該研究中選出的高產(chǎn)抗旱材料進(jìn)行深入研究，這將有助于檢測(cè)植物種內(nèi)的遺傳變異和分析基因組的結(jié)構(gòu)組成［21］，定位和克隆重要的農(nóng)藝基因（如抗病、抗旱基因）［22］，檢測(cè)和標(biāo)記數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs），并應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種以改良植物重要農(nóng)藝［23，24］，及通過采用DNA標(biāo)記的原位雜交方法構(gòu)建特定染色體的物理圖譜［25］，為其在生產(chǎn)中應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

航天誘變?cè)谲俎！⒓t豆草、沙打旺等豆科牧草上有所應(yīng)用，并表現(xiàn)出較好的誘變效果［17］。本研究首次將航天誘變應(yīng)用于菊科植物菊苣，獲得了部分優(yōu)良突變材料且能夠穩(wěn)定遺傳，進(jìn)一步驗(yàn)證了航天誘變處理變異頻率高、良性變異多、穩(wěn)定快的特點(diǎn)。證明通過航天誘變誘導(dǎo)菊苣突變體是有效的，為進(jìn)一步利用航天誘變，建立突變體庫提供了依據(jù)。

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