高溫脅迫下紫花苜蓿抑制消減文庫(kù)的構(gòu)建

韓明鵬，王彥華，高永革，張曉霞，蘇芳蕊，許紅，王成章＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州450002；2.河南省飼草飼料站，河南 鄭州450008；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與管理科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002）

紫花苜蓿（Medicagosativa）是在世界范圍內(nèi)栽培歷史最悠久、面積最廣泛的豆科牧草，堪稱“牧草之王”［1］。紫花苜蓿具有產(chǎn)草量高、富含蛋白質(zhì)、生物固氮能力強(qiáng)和適應(yīng)性廣的特性，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展、食品安全等具有重大作用。但隨著人類活動(dòng)的增加，全球氣溫逐年上升，高溫?zé)岷ψ兊梅浅Ｍ怀?，?yán)重抑制植物特別是紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育，影響到紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)［2，3］。高溫能使紫花苜蓿植株生長(zhǎng)緩慢、枯萎甚至死亡，病蟲(chóng)害增多，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，是限制其推廣利用的重要環(huán)境因子之一。目前高溫對(duì)紫花苜蓿的研究方面主要集中在高溫對(duì)紫花苜蓿生產(chǎn)性能的影響、紫花苜蓿適應(yīng)高溫脅迫的機(jī)制及其耐熱性評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇和可靠性評(píng)價(jià)的方法等方面［4－7］，而針對(duì)在分子水平尋找紫花苜蓿耐熱基因的研究還未有報(bào)道。

耐熱性是目前抗性研究中的一個(gè)重要方面，但耐熱性是一個(gè)非常復(fù)雜的性狀，長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)紫花苜蓿耐熱性的了解主要來(lái)自于生理學(xué)的研究，如有機(jī)溶質(zhì)的積累和熱誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生等［8－10］。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)耐熱性的了解逐漸深入到分子水平。由于植物的高溫脅迫反應(yīng)是一個(gè)多基因參與的系統(tǒng)調(diào)控過(guò)程，盡管傳統(tǒng)的研究方法已取得一些成果，但是要想從根本上闡明高溫脅迫機(jī)制尚有很大差距。這就需要在全基因組水平上對(duì)其進(jìn)行整合性研究。隨著生物技術(shù)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，目前已出現(xiàn)了一系列大規(guī)模分離差異表達(dá)基因的方法。

抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）是由Diatchenko等［11］于1996年以mRNA差異顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的篩選未知差異基因的新技術(shù)。采用該技術(shù)在較短時(shí)間內(nèi)即可獲得差異表達(dá)基因的cDNA片段，可使低豐度的mRNA得以高于1 000倍以上的富集，從而使某些低豐度表達(dá)的mRNA有望被檢出［12］。近年來(lái)SSH技術(shù)在植物抗逆性研究上展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。劉春燕等［13］構(gòu)建了大豆花葉病毒脅迫誘導(dǎo)的消減文庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行了初步分析，研究了花葉病毒脅迫下大豆基因的表達(dá)調(diào)控。夏卓盛等［14］以鋁離子脅迫的紫花苜蓿幼根為材料，構(gòu)建了紫花苜蓿鋁脅迫的抑制消減文庫(kù)，研究了鋁脅迫下的基因差異表達(dá)。Jin等［15］以鹽脅迫的紫花苜蓿10日齡幼苗為材料，構(gòu)建了紫花苜蓿鹽脅迫的抑制消減雜交文庫(kù)，對(duì)文庫(kù)及其部分耐鹽基因進(jìn)行了分析。而SSH文庫(kù)在紫花苜?？篃嵝匝芯糠矫娴膱?bào)道很少。

本研究以秋眠6級(jí)的紫花苜蓿ABI 700為材料，采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了高溫脅迫下紫花苜蓿幼嫩莖葉的正向抑制消減cDNA文庫(kù)，旨在為紫花苜蓿耐熱機(jī)制研究和耐熱相關(guān)基因的克隆提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本試驗(yàn)以秋眠6級(jí)的紫花苜蓿（ABI 700）為材料，產(chǎn)地為美國(guó)，以45℃高溫處理過(guò)的幼嫩莖葉為處理組（tester），以同一植株正常條件（22℃）下生長(zhǎng)的幼嫩莖葉為對(duì)照組（driver）。整個(gè)試驗(yàn)于2010年5月－2010年10月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（安陽(yáng)）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株 DH5α電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（E.coliElectro－Cell DH5α）、pMD 18－T Vector［（抗性標(biāo)記為氨芐青霉素（Amp）］，購(gòu)自 TaKaRa公司。

1.1.3 試劑和酶 總RNA提取試劑盒RNAiSo Plus、mRNA純化試劑盒OligotexTM－dT30＜Super＞mRNA Purification Kit、DNA片段純化試劑盒 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0、Taq DNA 聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司；抑制消減雜交試劑盒PCR－SelectTMcDNA Subtraction Kit和聚合酶 Advantage cDNA Polymerase Mix購(gòu)自Clontech公司；其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和mRNA的分離純化 紫花苜蓿幼嫩莖葉總RNA的提取采用寶生物公司（TaKaRa）的RNAiso Plus試劑，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定后，置于－70℃冰箱保存。mRNA的分離純化使用寶生物公司（TaKaRa）的 mRNA純化試劑盒 OligotexTM－dT30＜Super＞mRNA Purification Kit，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)純化mRNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 抑制消減雜交（SSH） 具體實(shí)驗(yàn)步驟按照 Clontech公司（美國(guó)）的 PCR－SelectTMcDNA Subtraction Kit的方法進(jìn)行。以45℃高溫脅迫下的紫花苜蓿幼嫩莖葉為試驗(yàn)方（tester），以正常條件下（22℃）生長(zhǎng)的紫花苜蓿幼嫩莖葉為驅(qū)動(dòng)方（driver），把從總RNA中分離純化的tester和driver組的mRNA分別逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，然后用四堿基序列的限制性內(nèi)切酶Rsa I將其充分酶切。酶切產(chǎn)物用常規(guī)的酚、氯仿和異戊醇純化。將酶切過(guò)的tester cDNA平均分成2份，在T4DNA連接酶的作用下分別與接頭1和2R連接，16℃連接過(guò)夜，制成tester－1cDNA和tester－2RcDNA，并進(jìn)行接頭連接效率的分析。對(duì)已經(jīng)加上接頭1和2R的tester cDNA分別與過(guò)量的未加接頭的driver cDNA進(jìn)行第1次消減雜交，雜交條件為98℃1.5min，68℃8h。之后，再加入新鮮變性的driver cDNA于第1次雜交的2組產(chǎn)物中，68℃雜交過(guò)夜，結(jié)束后加入200μL無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，混勻，68℃溫浴7 min。雜交稀釋后，根據(jù)接頭1和2R外側(cè)序列設(shè)計(jì)的PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）引物1對(duì)消減雜交產(chǎn)物進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增；第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用無(wú)菌水稀釋10倍，再用巢式PCR引物Nested primer 1和Nested primer 2R進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增。具體接頭和引物序列見(jiàn)產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建 第2次PCR產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0純化后，取4μL與pMD 18－T Vector克隆載體連接，16℃連接過(guò)夜，經(jīng)乙醇沉淀后，取2μL加入電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（E.coliElectro－Cell DH5α）中，混合液注入于冰水中預(yù)冷的0.1cm 電擊杯（Bio－Rad）中。1.5kV 電壓、200Ω電阻沖擊后，向電擊杯中迅速加入1mL預(yù)冷的LB培養(yǎng)基。將菌液置于離心管中37℃振蕩培養(yǎng)1h（180 r／min）。取100μL涂于含有氨芐青霉素的LB／X－gal／IPTG的固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，放入4℃冰箱1h充分顯色。培養(yǎng)皿上可見(jiàn)藍(lán)白分明的菌落。剩余培養(yǎng)液加入甘油，液氮速凍后，－70℃保存。

1.2.4 PCR鑒定重組子 隨機(jī)挑取120個(gè)白色單菌落，接種于含1mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）的離心管中，37℃輕搖6～8h。直接取1μL菌液作為PCR模板，以Nested primer 1和Nested primer 2R作為引物，PCR擴(kuò)增插入片段。10μL的反應(yīng)體系：模板1μL、Nested primer 1（10μmol／L）0.8μL、Nested primer 2R（10 μmol／L）0.8μL、dNTP（2.5mmol／L each）0.8μL、10×PCR buffer 1μL、Taq酶0.3μL，補(bǔ)無(wú)菌水至總體積為10μL。反應(yīng)程序：94℃10min；94℃30s，66℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃5min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將單克隆菌液加入無(wú)菌甘油至終濃度15%，用液氮速凍后，置于－70℃冰箱長(zhǎng)期保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取和mRNA的分離純化

總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其28S和18SRNA帶型清晰可見(jiàn)，且比例適當(dāng)（圖1）。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其 OD260／280在1.9～2.0，表明總RNA質(zhì)量好，純度高，滿足文庫(kù)構(gòu)建的要求?？俁NA經(jīng)純化試劑盒純化后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)其帶型呈彌散狀（圖1），紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其OD260／280≈2.0，表明純化后的mRNA質(zhì)量好，純度高，滿足文庫(kù)構(gòu)建的要求。

2.2 cDNA合成以及cDNA酶切效果分析

mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA后用限制性四堿基內(nèi)切酶Rsa I酶切，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析反轉(zhuǎn)錄及酶切效果。結(jié)果表明（圖2），反轉(zhuǎn)錄后的雙鏈cDNA片段大部分集中在1 000～3 000bp，符合實(shí)驗(yàn)的要求。酶切后的片段明顯較未經(jīng)酶切片段減小，說(shuō)明酶切比較完全，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 接頭連接效率檢測(cè)

dscDNA與接頭連接效率的高低是決定抑制性消減雜交成敗非常關(guān)鍵的一步。利用紫花苜蓿管家基因Actin的3′端（GCCGACCTCGTCATACTGGT）和5′端（TCTTTTGGATTGGGCTTCGT）特異引物（產(chǎn)物83bp）以及試劑盒所帶的3′端特異引物與PCR Primer 1（產(chǎn)物）對(duì)2組分別連接有 Adaptor 1（接頭1）和Adaptor 2R（接頭2R）的tester cDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示（圖3），管家基因的3′端特異引物與接頭的外側(cè)引物Primer 1組合的擴(kuò)增片段（連接接頭的PCR產(chǎn)物）大于管家基因3′端、5′端特異引物組合的擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果一致，灰度分析表明2組dscDNA接頭連接效率均在50%以上，接頭已經(jīng)成功的連接。

圖1 紫花苜蓿幼嫩莖葉總RNA及mRNAFig.1 Total RNA and mRNA from tender stems and leaves of alfalfa

圖2 紫花苜蓿反轉(zhuǎn)錄cDNA Rsa I未酶切與酶切Fig.2 Reverse transcription cDNA of alfalfa after Rsa I digestion and not Rsa I digestion

2.3 消減雜交效率的檢測(cè)

以蒺藜狀苜蓿的管家基因α－tubulin為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行消減雜交效率的檢測(cè)。引物序列為：3′（CACATTGCAAGCCGGTATGT）和 5′（ACCGGTCTCACTGAAGAASG）。同時(shí)，以未經(jīng)抑制性消減雜交的cDNA T l－c（在制備tester cDNA 連接2種接頭時(shí)，將剛加好樣還沒(méi)有進(jìn)行連接反應(yīng)的連接有Adaptor 1和Adaptor 2R的tester cDNA 各取2μL混合，然后進(jìn)行連接反應(yīng)即可）作為對(duì)照進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min擴(kuò)增，并分別在第18，23，28和33循環(huán)處各取5 μL進(jìn)行電泳，檢測(cè)消減雜交效率。結(jié)果如圖4所示，未消減產(chǎn)物中看家基因147bp片段在第28循環(huán)時(shí)出現(xiàn)，而消減產(chǎn)物中看家基因147bp片段未出現(xiàn)。由此可見(jiàn)，消減產(chǎn)物中看家基因表達(dá)豐度已大大下降，消減雜交已有效完成。

2.4 消減PCR結(jié)果

第1次和第2次PCR擴(kuò)增結(jié)束后，分別取tester消減、tester未消減、對(duì)照RNA消減、對(duì)照RNA未消減、PCR陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物6μL并排進(jìn)行電泳檢測(cè)。消減雜交第1次PCR結(jié)果（圖5）顯示，第1次PCR擴(kuò)增的電泳帶較弱，經(jīng)抑制消減雜交后擴(kuò)增出的cDNA片段大小介于250～1 000bp，而未經(jīng)抑制消減雜交處理擴(kuò)增出的cDNA片段大小介于100～2 000bp，并且經(jīng)過(guò)消減雜交后擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物亮度明顯弱于未經(jīng)過(guò)消減雜交的PCR產(chǎn)物，這也說(shuō)明消減雜交有效的完成。消減雜交第2次PCR結(jié)果（圖6）顯示，經(jīng)過(guò)2輪消減雜交和2輪PCR后，消減雜交后擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物亮度和未經(jīng)過(guò)消減雜交的PCR產(chǎn)物相當(dāng)，tester中的差異表達(dá)基因得到有效地富集和擴(kuò)增，這也說(shuō)明消減雜交是成功的。

2.5 消減文庫(kù)中插入片段的PCR鑒定

經(jīng)過(guò)2次選擇性PCR富集的消減產(chǎn)物第2次PCR產(chǎn)物純化后與pMD－18T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（E.coliElectro－Cell）中培養(yǎng)擴(kuò)增，得到消減文庫(kù)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定插入片段，引物采用第2次PCR時(shí)的巢式引物1和2R。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖7）顯示，文庫(kù)克隆的重組率為99%，片段大小集中分布于250～750bp。

2.6 cDNA文庫(kù)的滴度和重組率測(cè)定

從cDNA文庫(kù)中取50μL，涂于含IPTG和X－gal的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜后，計(jì)算菌斑個(gè)數(shù)，按下式計(jì)算cDNA文庫(kù)的滴度。分別計(jì)數(shù)藍(lán)斑和白斑的個(gè)數(shù)，計(jì)算重組率。結(jié)果表明，文庫(kù)滴度為4 230pfu／mL；重組率為97.8%。

2.7 BlastX分析及功能的預(yù)測(cè)

隨機(jī)挑取120個(gè)白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，其中的陽(yáng)性克隆送至北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的序列去除引物、接頭和載體序列，提交到NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)，部分比對(duì)結(jié)果如表1。

圖3 接頭連接效率檢測(cè)Fig.3 Detection of ligation efficiency of adapor

圖4 消減雜交效率檢測(cè)Fig.4 PCR analysis of subtraction efficiency

3 討論

Diatchenko等［11］于1996年建立了一種應(yīng)用PCR方法的抑制消減雜交技術(shù)。抑制消減雜交技術(shù)利用了消減雜交技術(shù)、限制性內(nèi)切酶與抑制性PCR相結(jié)合的方法，經(jīng)過(guò)2次雜交和2次PCR，以富集和獲得目標(biāo)片段，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）假陽(yáng)性率被大大降低，可獲得較多的特異性表達(dá)產(chǎn)物，陽(yáng)性率達(dá)94%［16］；2）具有高敏感性，均等化富集目標(biāo)片段，避免了表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）分析中高豐度基因重復(fù)測(cè)序的缺點(diǎn)，使得低豐度mRNA也能被檢測(cè)到［17］。因此SSH技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物差異表達(dá)基因的分離［18－21］。

圖5 消減產(chǎn)物第1次PCRFig.5 The first PCR products of subtracted

圖6 消減產(chǎn)物第2次PCRFig.6 The second PCR products of subtracted

圖7 PCR檢測(cè)消減cDNA文庫(kù)克隆插入片段Fig.7 Identification of the inserted cDNA fragments in subtractive cDNA library by PCR

表1 SSH cDNA文庫(kù)的BlastX分析及其功能蛋白的預(yù)測(cè)Table 1 BlastX analysis of SSH cDNA library and the prediction of functional proteins

本研究首次建立了紫花苜蓿高溫脅迫下差異表達(dá)基因的抑制消減cDNA文庫(kù)，對(duì)SSH文庫(kù)的各個(gè)關(guān)鍵步驟如：總RNA及mRNA質(zhì)量、Ras I的酶切效果、接頭的連接效率、消減效率和轉(zhuǎn)化效率等的檢測(cè)顯示，消減文庫(kù)有較高的質(zhì)量。構(gòu)建一個(gè)好的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)對(duì)起始mRNA的完整性和純度要求非常高。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，試驗(yàn)獲得的總RNA含量高，完整性好，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其OD260／280在1.9～2.0。mRNA的完整度和純度也達(dá)到了文庫(kù)構(gòu)建的要求，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其OD260／280≈2.0。本試驗(yàn)抑制消減雜交試驗(yàn)中，從反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及Ras I酶切的檢測(cè)、加接頭后的接頭連接效率到消減cDNA片段的消減效率分析，都隨時(shí)監(jiān)控著各個(gè)試驗(yàn)環(huán)節(jié)，保證最終獲得高質(zhì)量的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。利用T／A克隆技術(shù)，將特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物直接與T載體進(jìn)行連接，文庫(kù)的構(gòu)建采用DH－5α電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，大大提高了文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率。擴(kuò)增文庫(kù)后，經(jīng)過(guò)初步藍(lán)白班篩選120個(gè)陽(yáng)性克隆，菌落PCR擴(kuò)增電泳圖譜檢測(cè)，文庫(kù)滴度為4 230pfu／mL，文庫(kù)克隆的重組率為97.8%，片段長(zhǎng)度集中分布于250～750bp。這些結(jié)果直接說(shuō)明獲得了高質(zhì)量的正向差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。

綜上所述，利用SSH技術(shù)構(gòu)建紫花苜蓿高溫脅迫差異表達(dá)基因文庫(kù)，通過(guò)EST技術(shù)研究抗熱過(guò)程差異表達(dá)的抗熱相關(guān)基因的表達(dá)情況，從總體上闡述紫花苜?？篃釞C(jī)制已成為可行的研究方法?？篃峄虻难芯坎粌H僅是抗熱過(guò)程的識(shí)別和抗熱基因的開(kāi)啟，更是注重抗熱過(guò)程中系列基因的表達(dá)以及抗病信號(hào)的傳遞和級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這將更加有助于對(duì)抗熱機(jī)制的深入研究。

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