微生物有機肥對隴東烤煙中性致香物質(zhì)含量的影響及其機理初探

劉星，邱慧珍＊，張文明，李亞娟，滕桂香，賈歡歡

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州730070）

我國的煙葉種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，煙葉生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位，已連續(xù)十余年成為全國第一利稅大戶［1－3］。地處隴東黃土高原的甘肅省正寧縣煙區(qū)，屬于優(yōu)質(zhì)烤煙（Nicotianatabacum）種植的適宜區(qū)，烤煙栽培歷史悠久，烤煙生產(chǎn)已成為當?shù)馗幻駨娍h的支柱和特色產(chǎn)業(yè)。然而，近年來由于長期連作和大量施用化肥，忽略了有機肥的施用，造成煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)持續(xù)下降，尤其是煙葉內(nèi)在品質(zhì)下降，油份減少、香氣不足，導致種植效益下降［4，5］。因此，如何通過營養(yǎng)調(diào)控改善其品質(zhì)，提高煙葉致香物質(zhì)含量和香氣質(zhì)量是該縣烤煙種植中急需解決的問題。

煙葉的香氣量和香味是影響煙葉品質(zhì)和商品價值的主要因素之一，與煙葉中致香物質(zhì)含量密切相關(guān)［6］。研究表明，影響烤煙致香物質(zhì)含量的因素包括施肥、土壤條件、光照、溫度、水分、干旱脅迫、成熟度、采收及海拔等［6，7］，其中施肥尤其是施用有機肥是提高煙葉香氣物質(zhì)含量的最主要和最有效的措施之一［3，7］。目前，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中有機肥施用正作為一種環(huán)境友好型作物生產(chǎn)技術(shù)越來越受到重視［8］。煙田常用的有機肥有餅肥、堆肥和廄肥等，其中以餅肥最為普遍。有關(guān)餅肥在烤煙上的施用效果國內(nèi)已有大量的研究，施用適量餅肥可以提高烤煙的產(chǎn)量和產(chǎn)值［9，10］，提高土壤的生物活性［11］，改善煙葉品質(zhì)［12，13］，增加香氣物質(zhì)［14］。微生物有機肥是近年來推廣的一種新型肥料，它集有機肥和化肥的優(yōu)點為一體，并含有多種有益拮抗微生物，有緩解作物連作障礙的功效。增施微生物有機肥能夠顯著提高土壤供應(yīng)養(yǎng)分的能力，激發(fā)土壤中氮素、磷素的釋放，增加烤煙煙葉中的鉀含量，降低煙堿含量，減少氯含量［15］。目前，關(guān)于微生物有機肥在烤煙上的相關(guān)報道多集中在土壤理化性狀、養(yǎng)分供應(yīng)能力、生理代謝、葉片常規(guī)化學品質(zhì)上，而對最能表現(xiàn)烤煙商品特性的香氣性質(zhì)、含量、組成比例等方面卻鮮有報道，為此，本研究通過大田試驗探討微生物有機肥對隴東烤煙致香物質(zhì)含量的影響及其可能的機理，以期為當?shù)乜緹煼N植中有機肥的施用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

大田試驗于2009年在甘肅省慶陽地區(qū)正寧縣進行。正寧縣地處黃土高原溝壑區(qū)，屬大陸性季風氣候，為優(yōu)質(zhì)烤煙種植的適宜區(qū)。全縣烤煙主產(chǎn)區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)海拔一般處于1 177～1 250m，全年日照2 447.4h，日照率55%，烤煙生育期≥10℃年積溫為2 900℃，降水量約630mm，蒸發(fā)量1 500mm，無霜期180d左右。光照充足，熱量富裕。供試土壤為黑壚土，基本理化性狀為：有機質(zhì)12.5g／kg，全氮0.8g／kg，堿解氮64.6mg／kg，速效磷11.6 mg／kg，速效鉀162.5mg／kg，pH值（水土比5∶1）為8.3。

1.2 試驗設(shè)計與方法

田間試驗設(shè)2個處理：CK，不施微生物有機肥；BIO，施微生物有機肥，每處理3次重復，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積59.4m2（9.0m×6.6m），行距1.1m，株距0.6m，種植密度為1.515×104株／hm2。

微生物有機肥由南京農(nóng)業(yè)大學提供，含氮磷鉀8%，其中氨基酸態(tài)氮占總氮的60%以上，含抗土傳枯萎病的微生物數(shù)量大于108／g。移栽時在靠近煙苗根系底部集中施用，用量4g／株，60kg／hm2。2個處理化肥用量一致，氮肥用量為60kg N／hm2，N∶P2O5∶K2O比例1.0∶1.5∶3.0，氮肥用硝銨磷（N含量32%，P2O5含量4.4%），磷肥用過磷酸鈣（P2O5含量16%），鉀肥用硫酸鉀（K2O含量50%）。施肥和起壟同步進行，采用雙層施肥技術(shù)，下層肥料于起壟時施入，開溝20cm深，條施80%的氮肥、磷肥和鉀肥，上層肥料于移栽時施入，穴施全部微生物有機肥和剩余20%的氮肥、磷肥，20%的鉀肥于現(xiàn)蕾期噴施。其余栽培和田間管理措施均按當?shù)責熮r(nóng)習慣方法進行。

供試品種：當?shù)刂髟云贩NCV70，由正寧縣煙葉生產(chǎn)管理局提供，煙苗采用切塊育苗。

1.3 樣品采集與分析

起壟前采集土壤基礎(chǔ)土樣，測定土樣的基本理化性狀。移栽后0～120d內(nèi)每隔15d調(diào)查各小區(qū)烤煙葉片葉綠素含量。在田間條件下挑選無病蟲害、無生理病斑、無機械損傷的烤煙中部完全展開葉片，采用SPAD－502型葉綠素儀于主脈兩側(cè)，分別讀取3個讀數(shù)，并用6個讀數(shù)平均值代表該株烤煙的葉片葉綠素含量，每個小區(qū)隨機選取健壯程度和長勢一致的烤煙7株進行測定。同時取烤煙葉片混合樣殺青、烘干后測定葉片氮素含量。圓頂期在田間于上午10點左右采集新鮮無病害特征葉片測定相關(guān)酶活性，用抖土法采集根際土壤。各項指標測定均3次重復，求取平均值。葉綠素降解速度＝（前一次測定SPAD值－后一次測定SPAD值）／間隔天數(shù)。

烤煙成熟收獲后，于當?shù)乜痉績?nèi)進行烘烤，按小區(qū)分下部葉（從下至上第1～7位葉，去掉1～2片無效葉，共采收5片有效煙葉）、中部葉（第8～14位葉）和上部葉（第15～20位葉）各取烤后煙葉混合樣測定致香成分。樣品致香物質(zhì)測定在河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院國家煙草（行業(yè)）栽培生理生化重點實驗室進行，3次重復。

1.4 測定方法

葉片酶活性測定，硝酸還原酶：磺胺－萘胺比色法。蔗糖轉(zhuǎn)化酶：3，5－二硝基水楊酸比色法。

土壤堿解氮含量測定：堿解擴散法。葉片氮素含量測定：H2SO4－H2O2聯(lián)合消煮，蒸餾滴定法。

1.5 致香物質(zhì)測定

1.5.1 中性致香物質(zhì)的提取 中性致香物質(zhì)提取及定性定量分析采用HP5890－5972氣質(zhì)聯(lián)用儀。前處理采用水蒸氣蒸餾－二氯甲烷溶劑萃取法。同時蒸餾萃取裝置的一端接500mL圓底燒瓶，內(nèi)有10g煙樣、1g檸檬酸、350mL蒸餾水和0.5mL內(nèi)標（硝基苯）混合液，使用恒溫電熱套進行加熱；裝置的另一端連接盛有40mL二氯甲烷的250mL圓底燒瓶，該燒瓶置于恒溫水浴鍋中加熱，水浴溫度為60℃。同時蒸餾萃取2.5h。萃取完成后，加入10g無水硫酸鈉干燥有機相，然后于60℃水浴中濃縮至1mL左右即得煙葉精油。

1.5.2 中性致香物質(zhì)的定性和定量條件 將提取的煙葉精油，由GC／MS鑒定結(jié)果和NIST庫檢索定性。GC／MS分析條件，色譜柱：HP－5（60m×0.25mm×0.25μm）；載氣：氦氣；流速：0.8mL／min；進樣口溫度：250℃；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：177℃。升溫程序：初溫50℃，恒溫2min后，以2℃／min的速度升至120℃，5min后以2℃／min的速度升至240℃，保持30min；分流比15∶1；進樣量：2μL；電離能：70eV；質(zhì)量數(shù)范圍50～500；采用內(nèi)標法定量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，圖表繪制在Excel 2007軟件上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用微生物有機肥對煙葉中性致香物質(zhì)總量的影響

烤后煙葉樣品經(jīng)GC／MS測定和NIST庫檢索共定性和定量了28種主要中性致香成分，將這些致香成分按烤煙香氣物質(zhì)前體物共分成6類（表1）。

微生物有機肥處理BIO顯著提高了烤煙各部位葉片的中性致香物質(zhì)總量，與CK相比，增加了26.79%～134.33%，并以上部葉的增幅最大，總量高達1 810.72μg／g，說明在常規(guī)施用化肥的基礎(chǔ)上增施微生物有機肥能顯著提高煙葉中性致香物質(zhì)總量，提升煙葉的香味品質(zhì)。

烤煙不同葉位葉片的中性致香物質(zhì)總量對微生物有機肥的反應(yīng)顯著不同，以上部葉片的致香物質(zhì)總量對微生物有機肥的敏感程度最高，含量的增幅最大。與CK相比，上、中、下部葉的中性致香物質(zhì)總量分別增加了134.33%，81.03%和26.79%。

施用微生物有機肥后，不同葉位葉片的中性致香物質(zhì)總量的高低順序發(fā)生了變化，CK處理中各部位葉片中性致香物質(zhì)總量高低順序為上部葉＞下部葉＞中部葉，而在BIO處理中為上部葉＞中部葉＞下部葉，這可能是微生物有機肥影響煙株體內(nèi)干物質(zhì)和氮素在不同葉位葉片間的分配所致。在收獲的18片煙葉中，中部葉為第8～14片葉，占收獲葉片的39%，中部葉致香物質(zhì)總量的提高對增加烤煙單位面積的產(chǎn)值具有重要意義，煙葉致香物質(zhì)含量越高，品質(zhì)越好，中上等煙比例也越高，單位面積的產(chǎn)值越高。

2.2 施用微生物有機肥對不同種類中性致香物質(zhì)的影響

煙葉中致香物質(zhì)成分較多，不同致香物質(zhì)具有不同的化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，對人的嗅覺和味覺可以產(chǎn)生不同的刺激作用，形成不同的感官反應(yīng)，對煙葉香氣質(zhì)、香氣量和香型有不同的貢獻［16］。結(jié)果顯示（表1），正寧煙葉中性致香成分有西柏烷類降解產(chǎn)物1種，類胡蘿卜素降解產(chǎn)物13種，苯丙氨酸類降解產(chǎn)物4種，棕色化產(chǎn)物6種，新植二烯和其他致香物質(zhì)3種。含量較高的致香物質(zhì)組分主要有茄酮、β－大馬酮、香葉基丙酮、法尼基丙酮、苯甲醇、糠醛、3，4－二甲基－2，5－呋喃二酮和新植二烯等，較低的有氧化異佛爾酮、6－甲基－5－庚烯－2－醇和4－乙烯基－2－甲氧基苯酚等。

微生物有機肥處理對六大類中性致香物質(zhì)的效果明顯不同（表1），BIO處理大幅度提高了上部葉片中西柏烷類和類胡蘿卜素類致香成分總量以及中部葉苯丙氨酸類致香成分總量，較CK分別增加了67.57%，79.78%和261.78%，而棕色化產(chǎn)物類致香成分總量處理間差異不大。

測定結(jié)果同時表明，中性致香物質(zhì)以新植二烯為主，占中性致香物質(zhì)總量的79.67%～89.43%，而且處理間的差異也最大，這是導致處理間致香物質(zhì)總量形成巨大差異的主要原因，與趙銘欽等［17］的研究結(jié)果一致，BIO處理中上、中、下部葉片中新植二烯的含量分別比對照增加了157.33%，88.15%和31.17%，這可能是施用微生物有機肥后土壤的供氮能力增強，促進了新植二烯的前體物－葉綠素的合成所致。

2.3 施用微生物有機肥對煙葉葉綠含量的影響

葉綠素不僅是光合作用的重要色素，同時其含量和降解產(chǎn)物的積累量與煙葉的香氣物質(zhì)和品質(zhì)有密切關(guān)系［18］。BIO處理不僅提高了烤煙葉片的葉綠素含量，而且推遲了葉綠素含量的峰值（圖1）。

結(jié)果顯示，兩處理葉片葉綠素含量均表現(xiàn)為“先上升，后下降”的單峰曲線（圖1），但是峰值出現(xiàn)的時間明顯不同。CK處理葉綠素的峰值出現(xiàn)在移栽后60d左右，BIO處理出現(xiàn)在移栽后75d左右，推遲了大約15d。

葉綠素含量降低是植物重要的衰老指標之一，常常被用來作為植被長勢的重要參量［19］。葉片衰老最明顯的表現(xiàn)就是葉綠素逐漸消失，并伴隨葉片黃化以及最終脫落。煙葉的成熟（衰老）過程即是葉綠素大量降解的過程［20－23］，BIO處理葉綠素峰值的延后說明施用微生物有機肥延緩了烤煙成熟期。在烤煙生育后期，CK葉片葉綠素降解速度為0.41單位／d（移栽后60～105d），BIO處理為0.32單位／d（移栽后75～120d）。CK葉綠素后期降解較快，煙株干物質(zhì)積累較低，不耐衰老，造成一種“假熟”現(xiàn)象，導致相同部位煙葉提前采收，煙葉成熟時間也較BIO處理縮短。劉峰等［24］通過菜籽餅肥研究試驗也表明隨著有機肥的施用煙株的腳葉和頂葉成熟時間推遲，煙葉成熟期被相對拉長。

烤煙的成熟期主要進行內(nèi)在物質(zhì)特別是香氣前體物質(zhì)的生理生化轉(zhuǎn)化，成熟期的長短決定這種轉(zhuǎn)化能否充分進行，對烤煙內(nèi)在品質(zhì)產(chǎn)生重要影響［3，7］。微生物有機肥延緩了煙葉葉綠素的降解速度，延長了煙葉的成熟期，使最能體現(xiàn)烤煙品質(zhì)的中、上部葉片的生理功能期延長，有利于葉片干物質(zhì)的積累和化學成分及葉片內(nèi)含物的轉(zhuǎn)化。

2.4 施用微生物有機肥對土壤有效氮和煙葉氮含量的影響

在圓頂期測定了煙株根際和非根際土壤的有效氮含量（圖2），發(fā)現(xiàn)BIO處理較CK分別增加了18.66%和36.79%，說明施用微生物有機肥顯著增強了土壤的供氮能力。這主要是因為微生物有機肥本身含有一定量的有效氮，同時也促進了土壤有機氮的礦化所致。土壤供氮能力的提高，促進了煙株對氮的吸收，進而促進了葉綠素的合成。在整個大田生長期內(nèi)BIO處理的葉片N素含量均高于CK（圖3）。

圖1 施用微生物有機肥對烤煙葉片葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of bio－organic fertilizer application on chlorophyll contents in tobacco leaves

圖2 微生物有機肥對土壤堿解氮含量的影響Fig.2 Effects of bio－organic fertilizer on available nitrogen in soil

圖3 微生物有機肥對烤煙葉片氮素含量的影響Fig.3 Effects of bio－organic fertilizer on nitrogen contents in tobacco leaves

表2 微生物有機肥對圓頂期烤煙葉片C／N代謝關(guān)鍵酶活性的影響Table 2 Effects of bio－organic fertilizer application on activities of key enzymes in C／N mechanisms in tobacco leaves on dome period

2.5 施用微生物有機肥對圓頂期烤煙C／N代謝關(guān)鍵酶活性和葉片干物質(zhì)的影響

蔗糖轉(zhuǎn)化酶與植物組織的生長有密切關(guān)系，是衡量同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移、利用及植物細胞代謝和生長強度的指標，也是碳代謝的重要標志［25］，BIO處理極顯著提高了圓頂期葉片蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性（表2），較CK上升了30.02%，該酶活性的大幅度提高說明施用微生物有機肥能提高葉片的碳代謝強度，促進烤煙后期同化產(chǎn)物向小分子有機酸、醛類、酮類等葉片致香物質(zhì)的方向轉(zhuǎn)化和形成。

硝酸還原酶是高等植物氮素同化過程－硝酸光合作用的限速酶，其活性大小與氮代謝呈正相關(guān)，常用來表示氮代謝強度［13，25］。BIO處理的硝酸還原酶活性比對照增加了13.42%（表2），說明BIO處理促進了葉片的硝酸光合作用，促進了NO3－的還原作用，進而促進了氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。

3 討論

3.1 烤煙葉片葉綠素對施用微生物有機肥的響應(yīng)

新植二烯是由葉綠素裂解產(chǎn)生的葉綠醇脫水形成，為煙葉中重要的萜烯類化合物，能增進香煙的吃味和香氣，本身有一種弱的令人愉悅的氣味，又可通過降解轉(zhuǎn)化形成其他低分子致香成分［7］；有研究表明新植二烯是煙葉中性揮發(fā)物中含量最大的成分，可能是煙葉形成清香特色的主要因素之一［18］。BIO處理煙葉葉綠素含量提高，可能有幾個原因：1）微生物有機肥施用后，土壤氮素供應(yīng)的增強能夠使葉片積累更多的氮素用于葉綠素的生物合成。有研究表明葉綠素含量和烤煙葉片全氮之間存在極顯著的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)在各個測定時間均為顯著或極顯著正相關(guān)［26］。據(jù)測定，葉綠體占葉片干重的20%～30%，而葉綠體中含蛋白質(zhì)45%～60%，約有3 000多種各類蛋白［27，28］。BIO處理煙株氮素代謝的增強使得更多的氨基酸和蛋白質(zhì)得以合成，能夠完善葉綠素－蛋白復合體的組織結(jié)構(gòu)和葉綠體內(nèi)囊體膜的功能，增加煙葉對葉綠素a和b的“庫容量”。2）施用微生物有機肥提高煙葉蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性，增強煙株的碳代謝強度，為葉綠素的生物合成提供更多的碳骨架和能量［29］。3）微生物有機肥中氨基酸態(tài)氮占總氮的60%以上，在化學肥料施用的基礎(chǔ)上，隨著微生物有機肥的施用，少量的有機氮素進入土壤，這些有機氮素特別是氨基酸態(tài)氮可能也是影響烤煙葉片葉綠素含量的重要因素。武雪萍［30］研究發(fā)現(xiàn)，外源氨基酸的使用，不僅能提高葉片氨基酸的積累量，同時增強了煙葉葉綠體色素的合成，葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素的含量都有所增加。

3.2 施用微生物有機肥對烤煙成熟度的影響

煙葉采收成熟度是確定烤后煙葉形成最終產(chǎn)品的重要因素，也是煙葉質(zhì)量的核心，充分成熟的煙葉不僅易于烘烤，烤后煙葉外觀質(zhì)量高，而且醇化效果好，香氣量足，吸食效果佳［31］。新植二烯和大多數(shù)中性香味物質(zhì)的含量及醛類、酮類、醇類的總量都隨著成熟度的增加而呈增加趨勢［32］，成熟時煙葉的糖含量高，總氮、煙堿含量適宜，各種化學比值協(xié)調(diào)，煙葉香氣量足，香氣質(zhì)好，雜氣、刺激性明顯減輕，總體香、吃味最好，而成熟不夠或者過熟的煙葉，其內(nèi)在質(zhì)量明顯降低［33］。在本試驗中，BIO處理煙葉的成熟期相對延長，煙葉不僅生理成熟，且內(nèi)在物質(zhì)的生理生化反應(yīng)因后期植株C／N代謝的加強而能夠轉(zhuǎn)化充分進行，煙葉香味質(zhì)量達最佳狀態(tài)；CK處理煙葉葉綠素后期降解較快，煙株不耐衰老，煙葉在沒有達到生理成熟之前，就停止了自身的生長和干物質(zhì)積累，同時進行大量的營養(yǎng)物質(zhì)消耗或轉(zhuǎn)移，導致煙葉外觀呈黃化狀態(tài)，未老而先衰，屬于一種“假熟”狀態(tài)［7，23］。近年來當?shù)剞r(nóng)戶濫用化肥，忽略有機肥的施用，導致土壤板結(jié)、保水性差，土壤有機質(zhì)含量下降，生物活性降低，磷肥、鉀肥及微量元素等養(yǎng)分的利用率不高，難以滿足烤煙生長所需營養(yǎng)和平衡，這些外在環(huán)境的脅迫是造成煙株早衰的重要原因。同時長期的連作造成土壤有害病原菌繁衍，微生物多樣性失調(diào)，土壤生態(tài)肥力下降嚴重，煙株抗逆、抗病能力不高，這也導致了煙葉致香成分含量較低，香氣質(zhì)量不佳。蘇海燕等［34］研究發(fā)現(xiàn)，新植二烯、類胡蘿卜素類和苯丙氨酸類致香成分隨連作階梯下降，類西柏烷類和棕色化產(chǎn)物總體上呈降低趨勢，這對于烤煙生產(chǎn)來說嚴重不利。

微生物有機肥原料來源廣泛，其成分、組成比例、含量肥料種類間差異較大，其對于烤煙葉片致香物質(zhì)的影響可能是包括有益微生物和促生物質(zhì)在內(nèi)的各種肥料成分共同作用的結(jié)果，因此，在下一步的研究中有必要對其各種成分進行分解試驗，深入研究，以找出微生物有機肥對烤煙葉片香味品質(zhì)影響的機理。

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