ε-聚賴氨酸對冷鮮肉理化特性的影響

馮建嶺，李迎秋

1. 威海市食品藥品檢驗檢測中心（威海 264210）；2. 齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院（濟南 250353）

一般來說，肉及肉類產品水分活度高、蛋白占比高并且富含相對大量的自由氨基酸，因此比較容易被微生物污染[1]。用于評價肉及肉類產品腐敗變質的指標中，微生物特性和理化指標比較常見，如菌落總數（TBC）、pH、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量、高鐵肌紅蛋白（MetMb）含量和硫代巴比妥酸（TBA）值。Souza等[2]就通過測定TBC、pH、TVB-N含量及TBA值，對一些添加劑延長三文魚保質期進行系統(tǒng)研究。Duan等[3]利用監(jiān)測鱈魚pH、TBA值及TBC的變化，來評價魚油和殼聚糖復配制成涂層改善鱈魚片的微生物及一些理化特性。另外，Rodríguez-Carpena等[4]分析生豬肉餅中MetMb含量及TBA值的變化，結果表明，鱷梨的副產品可作為一種優(yōu)良的抑制劑，能減緩肉餅顏色的惡化、抑制脂質和蛋白質的氧化。

關于ε-PL對冷鮮肉理化特性影響的研究較少。因此，試驗通過觀察經ε-PL處理后冷鮮肉理化特性（TBC、pH、TVB-N含量、MetMb含量及TBA值）的變化，分析天然防腐劑ε-PL對冷鮮肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冷鮮肉（市售）；ε-聚賴氨酸（ε-PL，浙江新銀象生物有限公司）；胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂粉均為生化試劑，氫氧化鈉、硼酸、乙醇、氧化鎂、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、氯化鈉、冰醋酸（均為分析純，北京索萊寶科技有限公司）；甲基紅、次甲基藍、α-硫代巴比妥酸（天津市大茂化學試劑廠）。

1.2 試驗設備

透明門立式冷藏柜（SC-329，青島海爾股份有限公司）；絞肉機（JYS-A800，九陽器械有限公司）；雙人雙面凈化工作臺（SW-CJ-2F，蘇州凈化設備有限公司）；生化恒溫培養(yǎng)箱（SHP-150，上海精宏實驗設備有限公司）；酸度計（PB-10，賽多利斯科學儀器有限公司）；恒溫攪拌器（JB-2A，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司）；高速離心機（TG16-WS，長沙湘智離心機儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（DK-98-ⅡA，金壇市金南儀器廠）；立式電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KB，上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑的配制

ε-PL溶液：準確稱取ε-PL粉末，用蒸餾水分別稀釋至0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 g/100 mL，經高溫高壓滅菌后備用。

平板計數培養(yǎng)基：稱取5 g胰蛋白胨、15 g瓊脂粉、10 g葡萄糖及2.5 g酵母浸膏，加蒸餾水至1 000 mL，再用氫氧化鈉溶液（2 mol/L）調pH至7.0～7.2，在121 ℃、0.1 MPa條件滅菌22 min。

吸收液：稱取20 g硼酸，加無菌水至1 L，使其充分溶解。

混合指示劑：甲基紅-乙醇（2 g/L）與次甲基藍（1 g/L）指示劑等量充分混合。

氧化鎂懸液：稱取10 g氧化鎂，加無菌水至1 L。

磷酸緩沖液：稱取0.4 g二水磷酸二氫鈉、6 g十二水磷酸氫二鈉、9 g氯化鈉，加800 mL蒸餾水攪拌均勻，調pH至7.0，定容至1 L，經高溫高壓滅菌后放冷藏柜中保存。

TBA試劑：將2.883 gα-硫代巴比妥酸溶解在100 mL冰醋酸（95%）中，同時用沸水浴助溶。

1.3.2ε-PL溶液對冷鮮肉的預處理

用無菌刀具將冷鮮肉切成小塊（1 cm×1 cm×1 cm），平分為6份（每份約170 g）。這6份樣品分別浸泡在0，0.50，0.75，1.25和1.50 g/100 mL的ε-PL溶液中30 s，用無菌不銹鋼網篩抽濾1 min。裝入無菌塑料袋置于4 ℃冷藏柜中，備用。測定有關指標之前，先用絞肉機將冷鮮肉絞成糜狀。

1.3.3 冷鮮肉的微生物分析

在第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天，分別從每組樣品中取出5g冷鮮肉，與25 mL無菌磷酸緩沖液在9 000 r/min條件下均質2 min。把勻漿連續(xù)梯度稀釋，取出0.1 mL均勻涂在含有平板計數培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置于生化培養(yǎng)箱（37 ℃）中培養(yǎng)48 h，分別進行菌落總數計數，數據轉化成對數形式。試驗重復3次，取平均值。

1.3.4 冷鮮肉中pH的測定

對Souza等[2]和Duan等[3]的方法進行改進，用于冷鮮肉pH的測定，在第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天時，從各組樣品中分別取5 g冷鮮肉放入100 mL燒杯中，在攪拌機作用下與50 mL無菌水混勻?；旌弦航浂ㄐ詾V紙過濾后，用精密酸度計分別測定各組濾液的pH。做3組平行試驗，得平均值。

1.3.5 冷鮮肉中TVB-N的測定

參照Goulas等[5]的研究，對冷鮮肉的TVB-N值進行測定。利用電磁攪拌器，在貯藏期第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天時，分別從各組取5 g冷鮮肉與50 mL無菌水混勻30 min?；旌弦航洖V紙過濾后，濾液暫置于4 ℃冷藏柜中。將5 mL硼酸吸收液和4滴混合指示劑混合均勻，倒入錐形瓶中，放在蒸餾裝置冷凝器的底部。分別將2 mL各組備用濾液與等體積的氧化鎂懸液（10 g/L）均勻混合，將混合液放入蒸餾器的反應室中蒸餾5 min，同時，將蒸餾液滴入先前的錐形瓶（包括吸收液和混合指示劑）中。用鹽酸標準溶液（0.01 mol/L）滴定錐形瓶中混合液至藍紫色，并記錄鹽酸溶液的體積。同時做空白對照，各組樣品的TVB-N值按式（1）進行計算。

式中：V1為滴定樣品所消耗鹽酸標準溶液體積，mL；c為鹽酸溶液濃度，mol/L；V2為空白組所消耗鹽酸標準溶液體積，mL；m為樣品質量，g。

1.3.6 冷鮮肉中MetMb含量的測定

采用改進Maqsood等[6]的方法，測定高鐵肌紅蛋白含量。在貯藏期第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天，從各組樣品中分別取3 g冷鮮肉與10 mL磷酸緩沖液（pH 7.0）充分混勻，室溫反應30 min，在6 000 r/min條件下離心15 min，得上層清液。利用紫外可見分光光度計，分別在572，565，545和525 nm波長處下測定各組上清液的吸光度（A）。MetMb的計算如式（2）所示。

式中：R1，R2，R3分別為A572nm/A525nm，A565nm/A525nm，A545 nm/A525 nm。

1.3.7 冷鮮肉中TBA值的測定

參照Rodríguez-Carpena等[4]的方法，測定冷鮮肉中TBA值。在第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天，從每組樣品中取出10 g冷鮮肉分別浸泡于50 mL無菌水中（5 min），所得懸浮液轉移到500 mL的凱氏燒瓶中，逐滴加入4 mol/L的鹽酸溶液調至pH 1.5上下。選用液體石蠟作為消泡劑，并將幾顆玻璃珠放入燒瓶內。啟動蒸餾設備，開始蒸餾，沸騰10 min之后收集蒸餾液。準確量取5 mL蒸餾液置于25 mL具塞比色管內，加入等體積的TBA試劑劇烈振蕩混勻，在沸水浴下反應35 min，用5 mL無菌水作對照，測定混合液在532 nm波長下的吸光度（A），按照式（3）對冷鮮肉中的TBA值進行計算。

2 結果與討論

2.1 ε-PL處理前后冷鮮肉中TBC值的變化

如表1所示，隨著貯藏天數增加，所有樣品log10CFU/g的值均呈現上升的趨勢。在整個貯藏期間，對照組樣品log10CFU/g的值從3.48增加到10.62，處理組冷鮮肉log10CFU/g的值增長速度比對照組緩慢。此外，隨著ε-PL濃度增加，冷鮮肉的log10CFU/g值逐漸變小。方差分析（如表1所示）表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL比其他3個濃度（0.50，0.75和1.00 g/100 mL）的ε-PL具有更為顯著的抑菌特性（p＜0.05）。而且，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL在降低冷鮮肉的log10CFU/g值方面沒有顯著性差異（p＞0.05）。另外，在貯藏期第6天，經1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉感官特性易被接受。而在第8天時，所有樣品的log10CFU/g值均超過6.56，并且感官表現為“不可接受的”。結果表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能夠顯著抑制細菌的生長繁殖，使冷鮮肉的貨架期延長至6 d。

2.2 ε-PL處理前后冷鮮肉中pH的變化

在8 d的貯藏期內（4 ℃），經不同濃度ε-PL處理的冷鮮肉與對照組pH的變化如表2所示。隨著貯藏時間增加，所有冷鮮肉樣品的pH均呈現上升趨勢，而且，ε-PL處理組pH的增長速度要比對照組更緩慢，在整個貯藏期間，對照組的pH始終高于處理組。在第3和第4天，對照組冷鮮肉pH 6.12和6.60，即將腐敗變質，0.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉pH最高為5.99，仍然為新鮮肉（感官評價）。在貯藏期第6天，隨著ε-PL處理濃度增加，樣品pH逐漸降低，分別為7.00，6.42，6.30，6.00，5.78和5.60。分析結果顯示，經1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉pH顯著地降低（p＜0.05），而且這2個濃度ε-PL對冷鮮肉pH的影響沒有明顯差異（p＞0.05）。

據報道，隨著貯藏時間增加，肉中微生物活動及其代謝產物產生會導致蛋白質降解，產生一些堿性物質如氨及有機胺，從而引起pH增加[2,7]。試驗中冷鮮肉pH的增加趨勢與Jay等[8]的發(fā)現較為一致，研究認為pH增加是由于魚肉中細菌的生長繁殖。結果表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能夠抑制細菌的生長繁殖，減弱肉類蛋白的降解作用，延長冷鮮肉的貯藏時間。

表2 ε-PL處理前后冷鮮肉中pH的變化

2.3 ε-PL處理前后冷鮮肉中TVB-N值的變化

通常來說，TVB-N值是衡量冷鮮肉腐敗變質的重要指標，TVB-N含量越低，肉就越新鮮[9]。

不同濃度ε-PL對冷鮮肉中TVB-N值的影響如表3所示。冷鮮肉樣品的起始TVB-N值約9.0 mg/100 g，此時冷鮮肉質量特性良好。隨著貯藏時間增加，對照組的TVB-N值從9.0 mg/100 g增加到26.5 mg/100 g，處理組冷鮮肉的TVB-N值變化稍微緩慢。在第3天，經1.50，1.25和0.50 g/100 mLε-PL處理的樣品TVB-N值分別為9.9，10.4和16.0 mg/100 g，而對照組的TVB-N值達20.3 mg/100 g。第6天時，1.50，1.25，1.00，0.75和0.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉TVB-N值分別是14.6，15.8，18.0，20.0和20.9 mg/100 g（表3），而對照組TVB-N值為24.3 mg/100 g。方差分析顯示，相比其他3個濃度（1.00，0.75和0.50 g/100 mL），1.50 g/100 mL和1.25 g/100 mLε-PL能顯著降低冷鮮肉中TVB-N含量（p＜0.05）。結果說明，1.50 g/100 mL和1.25 g/100 mLε-PL能極其有效地預防冷鮮肉腐敗變質。2.4ε-PL處理前后冷鮮肉中MetMb含量的變化

對消費者來說，色澤是判斷冷鮮肉新鮮程度的一個重要指標[10]。肉的色澤改變正是由于肉中氧合肌紅蛋白、肌紅蛋白及高鐵肌紅蛋白之間的相互轉化。而且，冷鮮肉色澤從亮到暗的改變是由高鐵肌紅蛋白含量增加引起的[6,11]。

不同濃度ε-PL處理的冷鮮肉MetMb含量變化如表4所示。起始時，冷鮮肉中MetMb含量大約為8.0%，隨著時間增加，MetMb值逐漸變大。與對照組相比，處理組冷鮮肉的MetMb含量在整個貯藏期間的增長趨勢更為緩慢。在相同貯藏時間內，冷鮮肉中MetMb含量隨ε-PL濃度的增加而降低。在第6天時，對照組的MetMb含量（43.3%）是1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL處理組（20.1%和18.2%）的2倍多。此外，方差分析結果顯示，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能顯著影響冷鮮肉中MetMb含量（p＜0.05）。在貯藏期第8天，樣品中MetMb含量變化與第6天類似，但感官表現為“不可接受”。結果說明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能有效抑制冷鮮肉顏色改變，而且這種有效性依賴于ε-PL濃度的變化。

表3 ε-PL處理前后冷鮮肉中TVB-N值的影響 mg·100 g-1

表4 ε-PL處理前后冷鮮肉中MetMb含量變化 %

2.5 ε-PL處理前后冷鮮肉中TBA值的變化

在肉及肉制品加工過程中，TBA值是評價脂質氧化的一個關鍵性指標。通過測定丙二醛含量，檢測TBA值的變化，數值增加表明脂質氧化變得更加嚴重[2, 12]。

如表5所示，在這8 d的冷藏期間，所有樣品的TBA值都緩慢增加，起始值都低于0.9 mg/kg。用0，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 g/100 mLε-PL處理冷鮮肉在第8天的TBA值分別是1.53，1.56，1.51，1.58，1.40和1.80 mg/kg。統(tǒng)計分析顯示，隨著ε-PL濃度增加，所有樣品的TBA值沒有顯著性的差異（p＞0.05），表明ε-PL對冷鮮肉沒有抗氧化的效果。

表5 ε-PL處理前后冷鮮肉中TBA值的變化 mg·kg-1

3 結論

結果表明，與對照組相比，ε-PL作用于冷鮮肉時，隨著ε-PL濃度增加，其對冷鮮肉的菌落總數、pH、揮發(fā)性鹽基氮及高鐵肌紅蛋白含量等理化特性均產生顯著性影響。然而，ε-PL并不會影響冷鮮肉的硫代巴比妥酸值。試驗結果表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能顯著抑制微生物的生長繁殖，減弱冷鮮肉中蛋白質的降解作用，并阻止肉的顏色改變。因此，ε-PL有很好的潛力作為天然食品防腐劑，并能有效延長冷鮮肉的貨架期。