伊貝沙坦對胰島素抵抗大鼠腎組織bFGF的影響

牛凱 劉冰 王利軍 郭嵐

正常情況下，體內(nèi)多種因子及酶能調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成與降解，使它們處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，使得細胞外基質(zhì)過度合成、沉積和(或)降解受抑制，即可導致腎間質(zhì)纖維化。小管間質(zhì)纖維化程度預示著腎功能受損的程度，在腎臟疾病轉(zhuǎn)歸中起重要作用，決定慢性腎臟病患者的預后。本實驗選用SD大鼠，采用胰島素抵抗大鼠動物模型，通過檢測堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在腎組織的表達，研究伊貝沙坦沙坦在腎間質(zhì)纖維化中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性SD大鼠32只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為對照組，模型組，伊貝沙坦50mg/kg、100mg/kg干預組，每組8只。模型組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，對照組一直予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)直至實驗結(jié)束。干預組中伊貝沙坦(法國Sanofi公司提供)溶于蒸餾水按體重灌胃，飼料喂養(yǎng)與模型組相同。喂養(yǎng)12周后處死動物，觀察結(jié)果。

1.2 收縮壓(SBP)的測定 在每周日早晨8∶00～10∶00將大鼠在箱中預熱38℃，10min后，用尾袖法測量大鼠尾動脈血壓。

1.3 空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)測定 喂養(yǎng)12周后，大鼠禁食12 h過夜，血糖儀檢測空腹血糖(FBG);酶聯(lián)免疫法測定血清胰島素(FINS);計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，公式為(Ins×FBG)/22.5，統(tǒng)計時取自然對數(shù)使其符合正態(tài)性，再進行統(tǒng)計。

1.4 病理學檢查 SD大鼠處死后立即取腎臟組織液氮冷凍，－70℃保存。取腎臟組織，固定，包埋，切片觀察病理改變。采用免疫組化法分別測定腎組織中bFGF，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。通過顯微攝像系統(tǒng)采集圖像，取每個視野“陽性區(qū)平均光密度”的均數(shù)作為所測得的光密度值。并取平均數(shù)，即得腎小管間質(zhì)bFGF的表達均值，最后根據(jù)各組陽性表達的均值作比較。采用免疫組織化學法檢測bFGF在腎間質(zhì)細胞表達情況。操作步驟按試劑盒說明書進行。陽性點在光學顯微鏡呈黃色至棕褐色。

1.5 統(tǒng)計學分析應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠的血壓變化 模型組收縮壓較對照組、伊貝沙坦50干預組高，伊貝沙坦100組血壓明顯低于于其他3組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 4組大鼠喂養(yǎng)12周血壓變化

2.2 4組大鼠 FBG、FINS、HOMA-IR和bFGF變化 實驗結(jié)束時4組動物FBG差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。模型組FINS水平顯著高于其他3組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組HOMA-IR明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。對照組大鼠腎臟中的bFGF僅在腎間質(zhì)細胞中見少量表達。模型組大鼠腎組織中腎間質(zhì)細胞中可見大量棕黃色顆粒，腎間質(zhì)中bFGF陽性表達明顯增多。伊貝沙坦50組bFGF陽性表達明顯低于模型組，伊貝沙坦100組bFGF陽性表達明顯低于伊貝沙坦50干預組(P ＜0.01)。見表1。

表1 4組FBG、INS、ISI和bFGF比較 n=8，

表1 4組FBG、INS、ISI和bFGF比較 n=8，

注:與對照組比較，*P ＜0.05，與模型組比較，#P ＜0.01;與伊貝沙坦50組比較，△P ＜0.01

對照組△△

3 討論

腎小管間質(zhì)纖維化，是一種獨立于病因之外的持續(xù)進展過程，并是各種原發(fā)或繼發(fā)性腎臟疾病不斷進展，導致腎臟正常組織結(jié)構(gòu)被細胞外基質(zhì)所取代，并伴隨腎臟功能不可逆損害的病理過程［1］，是導致終末期腎衰竭的共同通路，且腎功能減退與腎間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)。多數(shù)學者認為bFGF對成纖維細胞有很強的促細胞分裂增殖活性，TGF-β1和bFGF在刺激腎間質(zhì)基質(zhì)過程中有著重要作用［2］。

本研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖喂養(yǎng)造成大鼠的血壓升高，F(xiàn)INS升高，HOMA-IR也明顯升高，而空腹血糖無明顯差別。研究結(jié)果說明高脂高糖喂養(yǎng)組大鼠在實驗結(jié)束時已造成胰島素抵抗，處于高胰島素血癥和葡萄糖耐量異常的時期，但尚未進展為糖尿病，接近原發(fā)性高血壓胰島素抵抗的模型［3］，造模成功。

FGF是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽，其中bFGF是研究最廣、最具有生物效應、也是作用最廣泛的成纖維細胞生長因子之一;bFGF主要作用調(diào)節(jié)細胞增殖。bFGF廣泛存在于多種組織中，能夠以分泌的方式促使系膜細胞增殖及其產(chǎn)生細胞外基質(zhì)［4］，bFGF是一種非糖基化糖鏈多肽，因其具有刺激成纖維細胞分裂增殖作用而得名。研究表明腎小管上皮受損可刺激bFGF的過度分泌，bFGF可通過自分泌和旁分泌機制引發(fā)腎小管上皮和間質(zhì)細胞增生及進一步分泌bFGF，進而促進成纖維細胞增生以及膠原合成，從而促進腎小管間質(zhì)纖維化［5］。

bFGF是以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用，并有可能通過不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—高爾基體通路的細胞胞吐作用將其釋放至胞外，并作用于靶細胞。成纖維細胞是腎間質(zhì)纖維化的主要效應細胞，bFGF能夠刺激細胞增殖及細胞外基質(zhì)合成，故在腎小管間質(zhì)纖維化過程中起重要作用。正常腎組織的腎小球、腎血管、間質(zhì)及部分腎小管的成纖維細胞樣細胞內(nèi)有bFGF蛋白及mRNA的低表達。在本研究中，對照組大鼠腎臟中的bFGF僅在腎間質(zhì)細胞中見少量表達，腎小球細胞無表達，但在模型組大鼠腎組織中腎間質(zhì)和腎小管上皮細胞中可見大量棕黃色顆粒，表明隨著腎間質(zhì)纖維化的程度加重bFGF的表達而增加。伊貝沙坦組bFGF陽性表達明顯低于模型組，大劑量伊貝沙坦對bFGF陽性表達明顯低劑量組，顯示伊貝沙坦對腎間質(zhì)bFGF的表達有抑制作用，伊貝沙坦大劑量對腎間質(zhì)纖維化有抑制作用。

1 Grande MT，Lopez-Novoa JM.Fibroblast activation and myofibroblast generation in obstructive nephropathy.Nat Rev Nephrol，2009，5:319-328.

2 Pawlak J，Klim B，Szkudlarek M，et al.The formation of new blood vessels in coronary artery disease:where we are now.Postepy Hig Med Dosw，2004，58:358-363.

3 Shridhar NI，Michael JK.Effect of acute and chronic Irbesartan treatment on glucose tolerance and insulin sensitivity in fructose-fed rats.Am J Hypertens，1996，9:662-668.

4 Liu XH，Zhao XM.Perlecan participates in the protection of ischemic myocardium induced by basic fibroblast growth factor:experiment with rats.National Med J China，2007，87:1857-1861.

5 徐曼.成纖維細胞生長因子及受體在腎小管間質(zhì)纖維化過程中的表達.重慶醫(yī)科大學學報，1999，24:239-241.