棉花根系分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的影響

石明旺,杜開書,鄧天福

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

棉花枯萎病是由棉花枯萎鐮孢菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum（Atk.）Synder et Hausen）引起的危害嚴(yán)重的毀滅性棉花病害之一,當(dāng)環(huán)境條件利于枯萎病發(fā)生情況下可導(dǎo)致棉花的大幅度減產(chǎn)[1-2].

選育和利用抗病品種是控制作物病害最為經(jīng)濟(jì)有效的措施,但由于棉花枯萎病病源菌、寄主抗性遺傳規(guī)律、抗病機(jī)制等有關(guān)基礎(chǔ)研究薄弱,棉花抗枯萎病育種研究進(jìn)展緩慢,目前我國(guó)所選育的棉花品種其抗枯萎病性與棉花生產(chǎn)的需求尚有一定差距[3].另外,缺乏抗枯萎病的抗源種質(zhì)和有效的抗枯萎病鑒定選擇方法也是影響棉花育種進(jìn)展的重要因素[4].因此,深入開展棉花抗枯萎病的機(jī)制、遺傳研究,發(fā)掘和尋找與棉花抗枯萎病相關(guān)的性狀和指標(biāo)對(duì)于棉花抗枯萎病育種具有重要意義.研究不同抗性水平的棉花品種的根系分泌物成分可以揭示棉花枯萎病的發(fā)病機(jī)制,以指導(dǎo)棉花抗枯萎病育種和枯萎病防治工作.

根系分泌物是指植物在生長(zhǎng)過(guò)程中,通過(guò)根系向生長(zhǎng)基質(zhì)中釋放的各類物質(zhì),包括低相對(duì)分子質(zhì)量的有機(jī)物質(zhì)、根細(xì)胞脫落物及其分解產(chǎn)物、高相對(duì)分子質(zhì)量的黏膠物質(zhì)、氣體、質(zhì)子和養(yǎng)分離子等.根系分泌物是保持根際微生態(tài)系統(tǒng)活力的關(guān)鍵因素,也是根際微生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)遷移和調(diào)節(jié)的重要組成部分.根系分泌物可改變根際物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì),改善和緩解植物在養(yǎng)分缺乏或金屬毒害條件下的生長(zhǎng)狀態(tài),使植物適應(yīng)外界環(huán)境變化得以生長(zhǎng).研究證明,根系分泌物中自毒性化感物質(zhì)的積累與連作障礙有著密切的關(guān)系.因此研究植物根系分泌物是一項(xiàng)具有重要意義的工作.本文采用棉花苗期的根系分泌物來(lái)測(cè)定其對(duì)棉枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)發(fā)育情況的影響,從而可以判斷棉花的根系分泌物對(duì)棉枯萎病是否有影響作用.

1 材料與方法

1.1 供試材料

棉種是百棉一號(hào)、HN68和無(wú)毒棉3種種子材料；培養(yǎng)用土從河南科技學(xué)院試驗(yàn)田中取得,經(jīng)破碎處理,并去除雜質(zhì)；采用自制營(yíng)養(yǎng)缽培養(yǎng)棉種發(fā)芽,然后采用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培；菌種由河南科技學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供,并經(jīng)課題組擴(kuò)繁培養(yǎng),獲得足量菌種；采用PSA培養(yǎng)基擴(kuò)繁菌種及后期的接菌試驗(yàn).

1.2 棉花的培養(yǎng)

棉種在實(shí)驗(yàn)室條件下經(jīng)溫湯浸種方法處理,將“三開一涼”60～65℃的溫開水倒入缸內(nèi),放入篩選好的棉種,攪拌均勻,浸悶30 min后撈出,晾至種毛微白即可催芽或拌藥播種.采用自制營(yíng)養(yǎng)缽在實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)培養(yǎng),每缽內(nèi)放5粒種子,每品種培養(yǎng)6缽,共30株.

1.3 根系分泌物的收集和處理

棉苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí),取生長(zhǎng)一致的棉苗移栽至三角燒瓶中,采用1/2 Hoagl-and營(yíng)養(yǎng)液水培,在移栽過(guò)程中棉苗根系要充分沖洗,去除其上附著的土壤,同時(shí)避免傷根.在通風(fēng)透光良好的環(huán)境下每天定時(shí)振蕩培養(yǎng),5 d后分別從營(yíng)養(yǎng)液中挑選20株棉苗,將棉苗根部用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗3～5次,分別放于大燒杯中,注入400 mL無(wú)菌蒸餾水,對(duì)根系進(jìn)行遮光,在室內(nèi)通風(fēng)處培養(yǎng),每天上午10：00至下午3：00對(duì)棉苗進(jìn)行照光（自然光）,照光結(jié)束后,迅速對(duì)培養(yǎng)液過(guò)濾收集并低溫保存,連續(xù)收集3次.將多次收集液混合,35℃恒溫條件下濃縮至原體積的1/25,低溫保存.原收集液每20 mL含1株棉花5 h水培條件下的根系分泌物,濃縮后0.8 mL收集液即為單株5 h的根系分泌量.

1.4 枯萎病菌孢子懸浮液的制備

將培養(yǎng)的枯萎病菌菌落用無(wú)菌水沖洗于三角瓶?jī)?nèi),充分震蕩搖勻,用無(wú)菌紗過(guò)濾得到其孢子懸浮液,經(jīng)顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì),孢子濃度為2.4×107個(gè)/mL,孢子懸浮液現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.5 根系分泌物對(duì)孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

采用凹玻片法.將根系分泌物定量加入凹槽中,再定量加入孢子懸浮液,混合后將凹玻片放入加蓋瓷盤中,25℃溫箱中培養(yǎng),12 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況,每個(gè)品種重復(fù)4次,每重復(fù)檢查10個(gè)視野,最后計(jì)算出平均孢子萌發(fā)率,以無(wú)菌水培養(yǎng)作為對(duì)照.

1.6 根系分泌物對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定

先制備PSA培養(yǎng)基（每1 000 mL中含20 g瓊脂）,在倒PSA平板時(shí)加入1/4比例的用微波爐滅菌處理的根系分泌物提取液,每皿接3個(gè)直徑為0.5 cm的菌片,每品種重復(fù)6皿,對(duì)照4皿,在25℃溫箱內(nèi)培養(yǎng),分別于4 d、7 d和11 d測(cè)量菌落直徑,計(jì)算平均直徑并討論其對(duì)病菌生長(zhǎng)影響作用的大小.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性棉花品種根系分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

采用凹玻片法測(cè)定不同抗性棉花品種根系分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響,結(jié)果見表1.

表1 不同抗性棉花品種根系分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

從表1可以看出,清水平均孢子萌發(fā)率52.70%,與之相比,百棉一號(hào)的根系分泌物中孢子平均萌發(fā)率為27.60%,HN68的根系分泌物中孢子萌發(fā)率平均為50.73%,無(wú)毒棉的根系分泌物中孢子萌發(fā)率平均為45.08%.3種材料中百棉一號(hào)品種對(duì)棉枯萎病菌的孢子萌發(fā)有抑制作用,而HN68和無(wú)毒棉品種相對(duì)而言對(duì)棉枯萎病菌孢子萌發(fā)抑制作用小.多重比較結(jié)果顯示3種棉花在0.05和0.01水平上沒有顯著差異,但都與對(duì)照有顯著差異.

2.2 不同抗性棉花品種根系分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用平板培養(yǎng)法檢測(cè)不同枯萎病菌抗性棉花品種的根系分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響,檢測(cè)結(jié)果見表2.

表2 不同抗性棉花品種根系分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可見,無(wú)論是培養(yǎng)4 d、7 d還是11 d,在加有百棉一號(hào)根系分泌物的平板上,枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)都受到一定程度的抑制,平均抑制率為16.08%～29.78%；而加入HN68和無(wú)毒棉的根系分泌物的平板上枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)所受的抑制性較小,平均抑制率分別為7.63%～10.78%和4.39%～6.31%.隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,其抑菌效果也逐漸明顯.從表2還可以看出,根系分泌物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不如其對(duì)孢子萌發(fā)的影響大.

分別對(duì)不同棉花根系分泌物在4 d和11 d時(shí)對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)影響的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,采用標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)后,用最短距離法進(jìn)行分析,結(jié)果見圖1.

圖1 不同棉花根系分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)影響聚類分析

由圖1可知,用第4 d數(shù)據(jù)對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)影響進(jìn)行聚類分析,HN68、百棉一號(hào)與無(wú)毒棉首先聚在一起,最后與CK（清水）聚在一起.用第11 d數(shù)據(jù)對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)影響進(jìn)行聚類分析,HN68與無(wú)毒棉首先聚在一起,其次與百棉一號(hào)和CK（清水）聚在一起,樣本間及與對(duì)照差距減小.

3 結(jié)論與討論

枯萎病是一種土傳病害,根際微生物和根系分泌物等生態(tài)因素與土傳病害的病原菌生長(zhǎng)發(fā)育和植株抗病性有密切的關(guān)系[8].根際微生物除受土壤環(huán)境因素外,最重要的還是取決于根系分泌物.Singh認(rèn)為,不同棉花品種根系分泌物中氨基酸等成分的變化,影響著根際細(xì)菌種群的變化[9].測(cè)定結(jié)果表明,百棉一號(hào)根系分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)有一定抑制作用,而HN68和無(wú)毒棉根系分泌物對(duì)枯萎病菌的抑制作用相對(duì)不顯著[10],研究結(jié)果說(shuō)明棉花對(duì)枯萎病等土傳病害的抗性與根系分泌物對(duì)病菌的作用有一定關(guān)系.

本文僅對(duì)對(duì)根系分泌物進(jìn)行初步研究,棉花抗枯萎病機(jī)制是十分復(fù)雜的,除了根系分泌物中氨基酸和糖類物質(zhì)外,還與維生素、有機(jī)酸、生長(zhǎng)因子和抑制因子等諸多因子相關(guān),只有通過(guò)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)才能弄清棉花對(duì)枯萎病的抗病機(jī)制問(wèn)題.

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