微波輔助提取老鷹茶總黃酮及其抑菌活性研究

計(jì)紅芳,張令文,張磊,王青,張慧蓉

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

老鷹茶是以樟科木姜子屬植物毛豹皮樟（Litsea coreana L.）的嫩梢和葉片為原料,經(jīng)蒸汽殺青或沸水燙漂殺青后曬干或陰干制成的一種植物代用茶[1].其中,四川、重慶及貴州等地區(qū)飲用歷史悠久.老鷹茶所含的黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗肝纖維化、抑制亞硝化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等功效[2-7].

目前,人們對(duì)老鷹茶黃酮類化合物的生物活性開(kāi)展了一些研究工作,但對(duì)老鷹茶黃酮的微波輔助提取及抑菌活性方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.開(kāi)展老鷹茶黃酮的提取分離和抑菌活性的研究,旨在為植物源天然抑菌劑的研究開(kāi)發(fā)提供一定的理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

老鷹茶（2009年產(chǎn)）,購(gòu)自遵義市遵義縣；槲皮素對(duì)照品,購(gòu)于上海同田生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器設(shè)備

FW-400A型傾斜萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；WFJ7200可見(jiàn)光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；GZX-DH-30×35電熱恒溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-IB型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；LB-50L高壓滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠）.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 老鷹茶總黃酮含量的測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用Moreno等[8]的方法,并稍作修改.精密稱取槲皮素對(duì)照品5.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加80%乙醇適量,使充分溶解,放冷,用80%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得0.1 mg/mL對(duì)照品溶液.精密量取對(duì)照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置25 mL比色管中,分別加入10%硝酸鋁0.1 mL,1 mol/L乙酸鉀0.1 mL,加入80%的乙醇至10.35 mL搖勻.暗室反應(yīng)40 min后于415 nm處測(cè)吸光度.用最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得槲皮素含量y（mg）與吸光度A之間的回歸方程為y=220.82A-2.863（r=0.999 8）.

老鷹茶總黃酮的含量測(cè)定與計(jì)算方法：取0.15 mL定容后提取液于25 mL具塞試管中,其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法相同.總黃酮含量/（g/100 g）=（提取液中黃酮總量/所用脫脂老鷹茶粉的量）×100.

1.3.2 微波提取工藝條件的確定 精密稱取一定量的脫脂老鷹茶粉末,準(zhǔn)確加入一定體積的乙醇溶液,在給定微波條件下提取,經(jīng)過(guò)濾,定容,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后冷凍干燥得老鷹茶總黃酮提取物.此提取過(guò)程,受很多因素的影響,在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)主要研究了乙醇濃度、微波功率、微波時(shí)間、液料比等因素對(duì)提取效果的影響.

（1）微波提取單因素試驗(yàn)

乙醇濃度：精密稱取老鷹茶粉末1.0 g,加入30 mL30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液,室溫靜置30 min后,在微波中火下條件下處理30 s,取出過(guò)濾,定容測(cè)定總黃酮含量.

微波功率：精密稱取老鷹茶粉末1.0 g,加入30 mL60%乙醇后室溫靜置30 min,分別在微波高火、中高火、中火、中低火和低火條件下,處理30 s后,取出過(guò)濾,定容測(cè)定總黃酮含量.

微波時(shí)間：精密稱取老鷹茶粉末1.0 g,加入30 mL 60%乙醇后室溫靜置30 min,在微波中火條件下,分別處理10、20、30、40、50 s后,取出過(guò)濾,定容測(cè)定總黃酮含量.

液料比：精密稱取老鷹茶粉末1.0 g,依次加入10、20、30、40、50 mL的60%乙醇,室溫靜置30 min,在微波中火條件下處理30 s,取出過(guò)濾,定容測(cè)定總黃酮含量.

（2）最佳工藝條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定以乙醇濃度、微波功率、微波時(shí)間和液料比等4個(gè)因素,選用L9（34）正交表,進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素與水平表見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.3老鷹茶總黃酮的抑菌作用

總黃酮提取物的制備：取脫脂后老鷹茶粉末,加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇,液料比為40 mL/g,靜置提取30 min后,在中火微波下提取50 s,過(guò)濾后,濾液減壓濃縮,冷凍干燥得總黃酮粗提物.將提取物配制成10、25、40 mg/mL的溶液,于 0～4 ℃保存?zhèn)溆?

抑菌效果試驗(yàn)：細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基.將供試的大腸桿菌、炭疽桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、枯草桿菌分別接種到裝有培養(yǎng)基的試管內(nèi),于37℃培養(yǎng)24 h.取活化好的菌種斜面,用無(wú)菌生理鹽水配制成（1～10）×106個(gè)/mL的菌懸液,備用.以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[9].

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響 乙醇濃度對(duì)老鷹茶總黃酮提取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

由圖1可知,隨著乙醇濃度的增加,總黃酮含量增加.當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí),總黃酮的含量最高（4.66g/100g）；當(dāng)濃度繼續(xù)升高,總黃酮含量略有下降的趨勢(shì).因此,確定乙醇濃度70%時(shí)為提取效果最佳點(diǎn).

2.1.2 微波功率對(duì)提取效果的影響 微波功率對(duì)老鷹茶總黃酮提取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 微波功率對(duì)提取效果的影響

由圖2可見(jiàn),隨著火力的升高,總黃酮含量呈先上升再下降趨勢(shì).微波功率在低火至中火變化時(shí),總黃酮含量顯著增加；當(dāng)微波火力在中火時(shí),總黃酮含量最高（4.80 g/100 g）；當(dāng)微波火力在中高和高火時(shí),總黃酮含量有所下降,原因可能是過(guò)高的溫度會(huì)使部分黃酮遭到破壞.因此,微波功率最佳為中火.

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)提取效果的影響 微波時(shí)間對(duì)老鷹茶總黃酮提取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 微波時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由圖3可見(jiàn),微波提取時(shí)間從10～40 s時(shí),總黃酮含量顯著增加；當(dāng)微波時(shí)間在40 s時(shí),總黃酮達(dá)（4.50 g/100 g）；當(dāng)超過(guò)40 s后,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),總黃酮含量呈下降趨勢(shì).因此,提取時(shí)間以40 s為宜.

2.1.4 液料比對(duì)提取效果的影響 液料比對(duì)老鷹茶總黃酮提取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 液料比對(duì)提取效果的影響

由圖4可知,液料比從10 mL/g到40 mL/g時(shí),總黃酮含量逐漸增加；當(dāng)液料比大于40 mL/g時(shí),總黃酮含量增加趨勢(shì)不明顯.從提取效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮,液料比宜選擇在40 mL/g.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定以乙醇濃度、微波功率、微波時(shí)間和液料比為主要影響因素,選用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 微波提取正交試驗(yàn)結(jié)

由表2可見(jiàn),在試驗(yàn)范圍內(nèi),老鷹茶總黃酮的微波輔助提取最佳工藝為（A2B2C3D2）：乙醇濃度70%、微波功率中火、微波時(shí)間50 s、液料比40 mL/g.

通過(guò)極差分析,各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)椋何⒉üβ剩疽掖紳舛龋疚⒉〞r(shí)間＞液料比.

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

以乙醇濃度70%、微波功率中火、微波時(shí)間50 s、液料比40∶1為提取條件,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).老鷹茶總黃酮含量為 5.78 g/100 g（A2B2C3D2）,比正交試驗(yàn)的最優(yōu)組含量 5.66 g/100 g（A2B2C3D1）稍高,表明優(yōu)化出的試驗(yàn)條件是較為合理的.

2.4 老鷹茶總黃酮的抑菌活性

老鷹茶總黃酮抑菌活性結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 老鷹茶總黃酮提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用

由表3可見(jiàn),老鷹茶總黃酮除對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌無(wú)抑制作用外,對(duì)供試的其它細(xì)菌均有不同程度的抑制作用.在試驗(yàn)范圍內(nèi),隨著提取物的濃度越高,抑菌活性逐漸增強(qiáng).其中,40 mg/mL的提取物對(duì)炭疽桿菌的抑制程度最強(qiáng),抑菌圈直徑可達(dá)3.4 cm；其次為變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌.可以看出,老鷹茶總黃酮提取物具有一定的抑菌效果,市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景廣闊.

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了正交試驗(yàn),確定老鷹茶總黃酮的微波輔助提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度70%、微波功率中火、微波時(shí)間50 s、液料比40∶1.

極差分析表明,各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)椋何⒉üβ剩救軇舛龋疚⒉〞r(shí)間＞液料比.

老鷹茶總黃酮提取物除對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌無(wú)抑制作用外,對(duì)供試的其它細(xì)菌均有不同程度的抑制作用.

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