藻藍蛋白的純化及功能飲料開發(fā)

胡梁斌,王淼焱,李紅波,夏松

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

螺旋藻是一種多細胞的絲狀藍藻,含有豐富、均衡的營養(yǎng)成份和多種生理活性物質(zhì),是一種綠色功能性食品,具有極高的開發(fā)價值[1].藻藍蛋白是螺旋藻的主要功能成分之一,是其細胞光合作用捕捉光能的輔助色素,也是一個具有生物活性功能的天然藍色素蛋白,具有類似小牛血清生長因子的功效.從螺旋藻中提取的藻藍蛋白不但是一種重要的植物蛋白質(zhì)資源,而且還將是多種功能食品的重要基料.然而,近年來由于工業(yè)廢水造成的環(huán)境重金屬污染,以及水體富營養(yǎng)化造成的有毒藍藻污染,使螺旋藻原料面臨重金屬和藍藻毒素污染風險.

本文針對螺旋藻中藻藍蛋白進行開發(fā),運用雙水相萃取法和等電點沉淀法等對藻藍蛋白進行純化,消除重金屬和藻毒素污染,獲得的高質(zhì)量藻藍蛋白原料被進一步開發(fā)為功能性飲料.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻片為市售產(chǎn)品；蘇打水為食品級；磷酸鹽、氯化鎘、硝酸、硫酸等均為無機分析純；微囊藻毒素標準品購于Sigma公司.

1.2 藻藍蛋白濃度和純度的測定

取藻藍蛋白溶液,分別在 280、615、650、750 nm 下測其吸光度,吸光度值分別記為：A280、A615、A650、A750.藻藍蛋白溶液質(zhì)量濃度的計算公式[2]如下：

其中：A'615=A615-A750,A'650=A650-A750

藻藍蛋白溶液純度的計算公式如下：

1.3 藻毒素測定方法

藻毒素通過HPLC（AglientHPLC1100）檢測,采用C18柱（Cosmosil5C18-AR,column 250 mm×4.6 mm,Japan）,柱溫控制在 40 ℃,檢測波長為 238nm,流動相為 0.05%（V/V）三氟乙酸∶甲醇 =45∶55,流速為 1mL/min.

1.4 含污染物的藻藍蛋白粗提液制備

將螺旋藻片充分研磨,稱取2 g粉末,加入pH=7.2質(zhì)量濃度為0.01 mol/L的磷酸緩沖液500 mL,在冰浴中超聲粉碎10 min,然后以4 000 r/min的速度離心20 min,上清液即為藻藍蛋白粗提液.向該粗提液中加入微囊藻毒素MC-RR和MC-LR（終濃度均為3.5 μg/mL）,以及氯化鎘母液（終濃度為2 μg/mL）.

1.5 藻藍蛋白的分離純化

向含污染物的藻藍蛋白粗提液中添加PEG4000,硫酸鈉、氯化鉀配置雙水相溶液[3],攪拌1 h,移入分液漏斗中,靜置過夜后分液.取上層溶液,調(diào)節(jié)等電點至3.4[4],靜置20 min后,以4 000 r/min的速度離心20 min,取沉淀,用pH=7.2質(zhì)量濃度為0.01 mol/L的磷酸緩沖液定容至25 mL.測藻藍蛋白提取液的質(zhì)量濃度和純度,以及藻毒素和鎘的質(zhì)量濃度.鎘通過ICP（電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀,Optima 2100,PE）測定.

1.6 藻藍蛋白飲料制備

1.6.1 制備飲料 將上述提純的藻藍蛋白溶液,用蘇打水稀釋至100μg/mL,進行感官評價,評定標準見表1.

表1 藻藍蛋白飲料的感官評定標準

1.6.2 藻藍蛋白飲料具體評定

參與評價的人數(shù)為10人,參照表1指標進行評價,記錄評價結(jié)果,通過矩陣計算最后結(jié)果.具體評價方法如下：

色澤、組織狀態(tài)：取50 mL混合均勻的被測樣品于潔凈的小燒杯中,置于明亮處,用肉眼觀察其色澤、透明濁度,檢查其有無可見雜質(zhì).

風味、口感：被測樣品容器開啟后,倒入潔凈的樣品杯中,立即用嗅覺仔細鑒別被測樣品的氣味；用味覺品嘗其滋味,檢查有無異味.

模糊綜合評判：事物具有多個指標,綜合考察各個指標,對該事物做出評價,這就是綜合評判問題,應用模糊數(shù)學進行綜合評判.

質(zhì)量指標集：u={風味、口感、色澤、均勻程度}

權(quán)重向量：a=（0.3 0.3 0.2 0.2）

評語集：v={優(yōu)秀,良好,一般,差}

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍蛋白的純化

表2 藻藍蛋白的純化

從表2可以看出,經(jīng)過雙水相和等電點沉淀后,藻藍蛋白的純度顯著提高,為原來的21.9倍.其中雙水相萃取的純化效率最高.但是整個提取過程中,藻藍蛋白略有損失,在等電點沉淀過程損失最大.

2.2 藻藍蛋白純化后鎘離子質(zhì)量濃度變化

所購原料中的鎘離子質(zhì)量濃度含量較低僅為0.001 7 μg/mL,為了能夠反映出純化過程對鎘離子的去除效應,我們采用人工添加的方式,添加量為2 μg/mL,使粗提液中的鎘離子大幅度超標.然后通過雙水相和等電點沉淀后鎘離子的質(zhì)量濃度依然降到與原來相當?shù)乃?僅為0.002 3 μg/mL.

2.3 藻藍蛋白純化后藻毒素濃度變化

與鎘離子污染類似,為了能夠反應出純化過程對藻毒素的去除效應,采用人工添加的方式,使粗提液中的藻毒素含量大幅度超標（圖1）.然而通過雙水相和等電點沉淀后藻毒素的含量降到檢測線以下.

圖1 藻藍蛋白純化后藻毒素含量的變化

2.4 藻藍蛋白飲料評定

通過所制藻藍蛋白飲料的各項指標進行評分,結(jié)果見表3.

表3 飲料評價表

3 討論

雙水相萃取是蛋白質(zhì)等親水性大分子非常有效的分離手段[5].在本試驗中,它對于藻藍蛋白的分離純化起到了重要作用.此外,對于含量較高的組分分離,等電點沉淀也是一種非常高效的分離方法[6].在螺旋藻中,藻藍蛋白的含量非常豐富,因此,等電點沉淀法適合藻藍蛋白的分離.通過雙水相萃取和等電點沉淀,不僅使藻藍蛋白的純度大幅提高,而且還能夠有效除掉其中可存在的藻毒素和重金屬污染.因此該純化流程可以應用于藻藍蛋白的安全性開發(fā).

制得的藻藍蛋白飲料中藻藍蛋白的濃度以其發(fā)揮最大功能作用時的濃度為準.在該濃度下,藻藍蛋白的飲料感官評定為良好.其中風味評分較低,是飲料感官品質(zhì)提升的主要障礙,這是藻藍蛋白自身的特點所決定的.藻藍蛋白是卟啉類色素蛋白,具有很高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療價值,被聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）譽之為“二十一世紀最理想和最完美的食品”[7].本工藝所加工的飲料風味協(xié)調(diào),愉悅清爽,特別是腥味得到較好的去除.但與本飲料所具有的卓越功能相比,其感官性質(zhì)還有待于進一步改善.

[1]賀玉衡,王世賓.螺旋藻食品在東方的發(fā)展[J].食品工業(yè)科技,1999,20（6）：9.

[2]楊立紅,鄒寧,孫東紅,等.魚腥藻藻藍蛋白的提取[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31（2）：135-138.

[3]劉楊,王雪青,龐廣昌,等.雙水相萃取法富集分離螺旋藻藻藍蛋白的研究[J].海洋科學,2008,32（7）：30-37.

[4]Patil G,Chethana S,Sridevi A S,et al.Method to obtain C-phycocyanin of high purity[J].Journal of Chromatography A,2006,1127（1/2）：76-81.

[5]江詠,李曉璽,李琳,等.雙水相萃取技術(shù)的研究進展及應用[J].食品工業(yè)科技,2007,28（10）：235-238.

[6]王子佳,李紅梅,弓愛君,等.蛋白質(zhì)分離純化方法研究進展[J].化學與生物工程,2009,26（8）：8-11.

[7]丁玲英.2007中國直銷十大產(chǎn)品類別[J].知識經(jīng)濟,2008（1）：91-92.