口蝦蛄胚胎發(fā)育的研究

劉海映，秦玉雪，姜玉聲，王桂娥

(1.大連海洋大學遼寧省海洋牧場工程技術研究中心，遼寧大連116023;2.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

口蝦蛄Oratosquilla oratoria俗稱蝦爬子、螳螂蝦、蝦虎、琵琶蝦等，又名“東方蝦蛄”，隸屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、口足目、蝦蛄科、口蝦蛄屬，是常見的海洋經(jīng)濟甲殼動物?？谖r蛄主要分布于包括中國在內的西北太平洋諸國近海。其肉味鮮美，有很高的食用價值。近年來，由于過度捕撈與近海環(huán)境的破壞，導致口蝦蛄資源嚴重衰退，自然產(chǎn)量很難滿足市場需求。因此，口蝦蛄生物學及其人工育苗與養(yǎng)成技術的研究已引起人們的關注。

Hamano 等［1－4］和 Matsuura 等［5］于 20 世紀 80年代開始研究了口蝦蛄對人工洞穴的選擇、交配行為、產(chǎn)卵和護卵行為、攝食等。Ohtomi等［6］和濱野龍夫［7－8］分別對口蝦蛄的產(chǎn)卵場特征、產(chǎn)卵動態(tài)和蝦蛄的洞穴及相關生態(tài)特性進行了研究。王春琳等［9］、徐善良等［10］、劉海映等［11］對口蝦蛄的生物學特征及其繁殖生物學進行了研究;孫丕喜等［12］、王波等［13］、閻斌倫等［14］相繼對口蝦蛄的人工育苗技術進行了探索。另外，王春琳等［15－16］還對口蝦蛄之近親——黑斑口蝦蛄Oratosquilla kempi的人工育苗技術及其胚胎和幼體發(fā)育時期脂類與脂肪酸的組成進行了研究。然而，有關口足目動物胚胎發(fā)育的研究至今尚未見報道。本試驗中，作者在室內控溫條件下培育口蝦蛄親體，跟蹤觀察產(chǎn)卵與胚胎發(fā)育的過程，旨在為口蝦蛄的個體發(fā)育研究及其人工繁殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2009年4月28—30日，于大連市普蘭店沿海收購已交配的雌蝦蛄。選擇體表無傷殘、健康有活力的口蝦蛄 (210尾)作為試驗用親蝦蛄。每尾體長為12 cm左右，體質量為32 g。

1.2 方法

1.2.1 培育池 培育池為30 m3的水泥池，其中鋪設10 cm厚的海沙，埋入80個人工洞穴 (聚乙烯管直徑為6 cm);2個2.4 m3的玻璃鋼觀察池，其中鋪設5 cm厚的海沙，各放置12個人工洞穴，此洞穴為綠色透明管狀，半埋入沙中，以便觀察蝦蛄的產(chǎn)卵情況。池子上方覆蓋雙層遮陰網(wǎng)。采用加熱器控制水溫。

1.2.2 親蝦蛄培育 將親蝦蛄于培育池中暫養(yǎng)，日換水量為1/2，水溫恒定為 (18±1)℃。每日早晚各投喂1次鮮活菲律賓蛤仔和沙蠶。培育前期，親蝦蛄的攝食量較大，投餌前檢查以少有剩余為標準，確保親蝦蛄的營養(yǎng);培育后期，待產(chǎn)親蝦蛄的攝食明顯減少，此時應減少投餌，并及時清除殘餌，保證水質良好。挑取臨產(chǎn)的親蝦蛄轉入觀察池，每日升溫1℃，至21℃時保持恒定，以促使產(chǎn)卵。

1.2.3 胚胎發(fā)育觀察 口蝦蛄預產(chǎn)卵期間，每隔2 h觀察一次，及時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵口蝦蛄，用鑷子取卵，并記錄產(chǎn)卵時間。胚胎發(fā)育前期，每隔30 min取卵細胞15粒于顯微鏡 (Olympus CX41RF)下觀察并拍照;后期胚胎發(fā)育速度較慢，取樣頻率隨之降低，自囊胚期開始每隔8 h取卵1次。產(chǎn)卵與取樣觀察期間，采用加熱器控制水溫在 (21±1)℃。

2 結果

2.1 產(chǎn)卵

前期的研究發(fā)現(xiàn)，溫度對口蝦蛄性腺發(fā)育影響顯著，水溫為 (18±1)℃時性腺發(fā)育較快，而水溫為 (24±1)℃時性腺發(fā)育緩慢 (結果另文發(fā)表)。因此，本試驗中將親蝦蛄的培育溫度控制為18℃左右。

親蝦蛄為俯臥產(chǎn)卵，其間以3對步足支撐洞壁，有時也用第二顎足和尾扇支撐，顎足輔助收攏卵團。剛產(chǎn)出的卵不粘連，隨后卵粒間被附屬腺分泌物連接。每個卵周圍有多個卵柄，卵間形成立體的空間，而整個卵團也逐漸被一膜狀物包裹。每尾口蝦蛄的抱卵量約為3～5萬粒。卵團由第一、三、四、五顎足抱于頭胸部腹面，第二顎足用于防敵和輔助翻動、折疊卵團。取卵操作時，親蝦蛄受到刺激后，會緊抱卵團迅速返回洞穴深處躲避，有時甚至棄卵逃離，少數(shù)棄卵親蝦蛄待穩(wěn)定后，能主動抱回卵團。人工送還卵團能協(xié)助親蝦蛄重新抱卵，但對同一親蝦蛄連續(xù)多次取卵會導致卵停止發(fā)育，最終死亡。

2.2 胚胎發(fā)育

口蝦蛄受精卵行不完全表面卵裂，胚胎發(fā)育經(jīng)過受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、膜內無節(jié)幼體期、膜內溞狀幼體期等典型時期。水溫為(21±1)℃時，受精卵經(jīng)過18 d孵化為Ⅰ期假溞狀幼體。

2.2.1 受精卵 剛產(chǎn)出的受精卵為不甚規(guī)則的球形，之后逐漸變圓，卵徑為410～450 μm。卵黃量較多，分布于卵子中央，原生質分布于卵球表面，屬中黃卵，卵為淺黃色 (圖1－A1、B)。卵粒間由附屬腺分泌的“卵柄”相連 (圖1－C)。

2.2.2 卵裂期 產(chǎn)卵后1 h(圖1－A2)，卵裂開始。此時卵質與卵黃分開，之間出現(xiàn)一明顯裂溝，胚胎與卵膜出現(xiàn)明顯分離 (圖1－A3)。口蝦蛄受精卵為表面卵裂。經(jīng)過10 h左右，受精卵不斷分裂，依次進入4細胞期 (圖1－A4)、8細胞期 (圖1－A5)、16細胞期 (圖1－A6)至32細胞期 (圖1－A7)，此時可以見到分裂球大小不一，排列不整齊。

2.2.3 囊胚期 產(chǎn)卵后25 h，細胞進一步分裂，數(shù)量不斷增多，單個細胞體積不斷變小，且無規(guī)則形狀，沿著卵黃外緣下包，形成表面囊胚。此時，囊胚呈球形，四周一層細胞包圍著中央的卵黃(圖1－A8)，受精卵進入囊胚期。

2.2.4 原腸胚期 產(chǎn)卵后4 d，胚胎的一端出現(xiàn)透明區(qū)域，標志著進入原腸胚期。胚胎近前端不斷分裂的細胞形成胚區(qū)(germinal area)，隨后其邊緣形成一半圓形溝，此處細胞逐漸內陷，以此方式形成原腸 (圖1－A9)。陷入處即為原口或胚孔 (blasto pore)，是原腸腔與外界相通的開口，而整個區(qū)域稱為內胚層盤。陷入的內胚層細胞吸收卵黃，逐漸由內向外擴展，較大的細胞在原口邊緣呈圓錐柱狀，其胞核與胞質靠外端，而內端充滿卵黃。同時，囊胚腔逐漸縮小，由新生的原腸腔取代。原口形成后，胚區(qū)前端兩側的細胞迅速增殖，形成圓盤狀的細胞群，左右對稱排列，此為視葉原基，隨后將發(fā)育為視葉，最終成為一對復眼 (圖1－A9)。原腸胚后期，原口兩側形成兩個密集的細胞群，為腹板的原基。隨著細胞的增殖，原基不斷增大，并向原口處合并成為胸腹突。原口則被不斷增大的胸腹突所封閉，最終消失。

2.2.5 膜內無節(jié)幼體期 產(chǎn)卵后7 d，同側視葉原基與胸腹突之間的細胞密度較其它部位增加，形成左右對稱的兩個細胞團，并逐漸增大且向外側突出，發(fā)育成為大顎原基。在大顎原基與視葉原基之間，靠近大顎原基，出現(xiàn)一對細胞群突起，此為第二觸角原基。隨后，在第二觸角原基與視葉原基之間又出現(xiàn)一對細胞群突起，為第一觸角原基。大顎、第一觸角與第二觸角原基的出現(xiàn)是甲殼動物膜內無節(jié)幼體期的標志［17］。胸腹突不斷增長、增厚，其末端凹陷，胚胎前端兩側的視葉原基細胞不斷增殖，形成視葉 (圖1－A10)。此時，卵由黃色變?yōu)辄S褐色。

口蝦蛄與其它甲殼動物一樣都以末端芽殖的方式產(chǎn)生新的體節(jié)與附肢。無節(jié)幼體3對附肢所對應的3個體節(jié)已完全愈合，之后在大顎節(jié)與尾節(jié)之間通過出芽形成新的體節(jié)及相應的附肢，自第一小顎開始，逐節(jié)發(fā)生?？谖r蛄無節(jié)幼體期后期，頭胸部形成兩對小顎原基、兩對顎足原基。胸腹突增長，出現(xiàn)體節(jié)。在胸腹突的背側出現(xiàn)皺褶，為頭胸甲原基。

2.2.6 膜內溞狀幼體期 產(chǎn)卵后11 d，隨著胚胎透明部分所占比例的明顯增加，卵黃的比例相應減少。復眼原基部位出現(xiàn)色素顆粒，標志著胚胎發(fā)育至溞狀幼體期 (圖1－A11)。無節(jié)幼體期形成的3對附肢進一步增長、分節(jié)，呈肢芽狀，末端出現(xiàn)剛毛。隨著胸腹突細胞的不斷增殖，在胸腹突基部相繼形成3對步足原基?？捎^察到胸腹突末端背側的心臟出現(xiàn)緩慢不規(guī)則地跳動。后期，頭胸甲形成，胚胎分節(jié)明顯，解剖能夠較容易地區(qū)分頭胸部、胸部和腹部 (圖1－A12)。臨近破膜時，心跳連續(xù)，頻率加快，胚胎有收縮動作，并越加劇烈 (圖1－D)。

圖1 口蝦蛄的胚胎發(fā)育Fig.1 Embryonic development of the mantis shrimp

3 討論

3.1 胚胎發(fā)育的分期

胚胎發(fā)育是動物個體發(fā)育與進化生物學研究的重要內容之一。蝦蟹類動物種類眾多，胚胎發(fā)育的形式復雜多樣，其生物學特征往往因種而異。對于有抱卵習性的種類，胚胎發(fā)育往往要經(jīng)歷一段膜內幼體時期。中華絨螯蟹經(jīng)歷膜內無節(jié)幼體和膜內溞狀幼體期而孵化出膜［18］，而河流溪蟹等在淡水中繁殖的蟹類除了要經(jīng)歷上述兩個發(fā)育時期外，還存在卵內大眼幼體期［19－20］。目前，有關蝦蟹類膜內幼體的分期尚無統(tǒng)一觀點。趙云龍等［21］將羅氏沼蝦的胚胎發(fā)育過程分為卵裂期、囊胚期、原腸期、前無節(jié)幼體期、后無節(jié)幼體期、前溞狀幼體期和溞狀幼體期7個時期。慕峰等［22］認為，克氏原螯蝦的胚胎發(fā)育可以分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、前無節(jié)幼體期、后無節(jié)幼體期、復眼色素期、預備孵化期和孵化期9個主要時期。依據(jù)不同時期胚胎的典型特征，細化分期無疑將有助于深入解析個體發(fā)育的生物學機理，但對于實際生產(chǎn)應用則略顯繁瑣。本研究中，作者綜合現(xiàn)有觀點，將口蝦蛄胚胎發(fā)育過程分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、膜內無節(jié)幼體期、膜內溞狀幼體期6個主要時期。其中膜內無節(jié)幼體期與膜內溞狀幼體的分期分別以大顎、第一觸角與第二觸角3對附肢原基的出現(xiàn)，以及視葉色素的出現(xiàn)為劃分依據(jù)。本研究結果表明，口足類動物個體發(fā)育過程更接近于蟹類與螯蝦類，但與無節(jié)幼體時期就破膜孵化的對蝦類差異明顯［17］，進而從發(fā)育學角度證明了口足類在甲殼動物中具有較高等的進化地位。

3.2 水溫與胚胎發(fā)育時間

據(jù)報道，水溫為26℃時，羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergi和紅螯螯蝦Cherax quadricarintus的胚胎發(fā)育時間分別為20 d和30 d以上［23－24］。本研究結果表明，在平均水溫為21℃時，口蝦蛄胚胎歷時18 d孵化出膜，與胚胎發(fā)育過程相似的羅氏沼蝦和紅螯螯蝦相比速度較快。據(jù)日本學者Hamano等［25］報道，蝦蛄胚胎孵化時間與水溫呈正相關，其關系式為D=58.39－1.85T(R=－0.98)。由此可知，溫度越高，胚胎的孵化時間越短。然而，本試驗中發(fā)現(xiàn)，當孵化溫度高于24℃時，口蝦蛄棄卵嚴重，胚胎易壞死或停滯發(fā)育。這說明口蝦蛄胚胎正常發(fā)育的上限溫度可能為21～24℃，而準確的溫度上限有待于進一步研究。

3.3 胚胎的離體孵化

人工采卵易導致親蝦蛄產(chǎn)生應激反應，同時破壞卵團的完整，受精卵容易壞死。因此，試驗期間難以從同一個體的卵團中取卵，致使胚胎發(fā)育觀察不連續(xù)。本試驗中通過增加取樣群體數(shù)量，并采取分別記錄、取樣的方法，將整個胚胎發(fā)育過程連接，以保證結果完整。然而取樣個體的差異也會影響結果的準確性，在掌握口蝦蛄受精卵發(fā)育最適條件的基礎上，建立離體孵化技術是解決這一問題的有效途徑。

據(jù)報道，日本沼蝦Macrobrachium mipponensis離體受精卵在適當條件下能夠正常孵化［26］。鋸緣青蟹離體受精卵也能正常發(fā)育，孵化率達95%［27］。本試驗中多次取出孵化早期 (受精卵、二細胞期、8細胞期、囊胚期)的口蝦蛄卵進行離體孵育，但發(fā)現(xiàn)離體卵不能正常發(fā)育，隨著離體孵化時間的延長，胚胎顏色變深，并大量死亡?？谖r蛄受精卵的離體孵化技術還有待于進一步研究。

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