蘇木素在真菌性角膜炎診斷中的應(yīng)用

吳勝哥

真菌性角膜炎是我國(guó)常見(jiàn)的致盲眼病。近年來(lái)，真菌性角膜炎發(fā)病率不斷上升，部分地區(qū)成為首位感染性眼?。?-3］。真菌性角膜炎的確診一般依靠涂片細(xì)胞學(xué)和真菌培養(yǎng)為主［4］。真菌培養(yǎng)是真菌性角膜炎診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［4-5］，但真菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，等待結(jié)果往往延誤治療［5］。傳統(tǒng)KOH濕片法檢查真菌性角膜炎的診斷陽(yáng)性率低，誤診率高。如何快速準(zhǔn)確地診斷真菌性角膜病是目前研究的熱點(diǎn)［4］。本研究收集2006年6月至2011年6月期間臨床診斷為真菌性角膜炎病例59例，研究蘇木素在真菌性角膜炎早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2006年6月至2011年6月期間臨床診斷為真菌性角膜炎病例，59例患者中男36例，女23例;右眼31例，左眼28例;年齡15～67歲，平均49.3歲;農(nóng)民38例，工人13例，其他8例;眼外傷史51例，引起外傷的異物為植物性(谷物、草、木頭、竹子、樹(shù)葉等)31例，土壤14例，焊屑9例，其他5例;3例既往有使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑病史。

1.2 方法

1.2.1 角膜刮片操作方法 倍諾喜表面麻醉，75%酒精消毒眼周皮膚，開(kāi)瞼器開(kāi)瞼，用消毒手術(shù)刀刮取角膜潰瘍表面、周邊部及基底部物質(zhì)，標(biāo)本涂片行蘇木素染色和KOH濕片法查找真菌，并行真菌培養(yǎng)。

1.2.2 KOH濕片法查找真菌 取適量角膜潰瘍刮取物涂片于載玻片上，盡量將刮取物薄層鋪開(kāi)，滴加10%氫氧化鉀1滴，蓋上蓋玻片，放置10 min，使雜質(zhì)溶解，顯微鏡下先用低倍鏡找到標(biāo)本位置，再用高倍鏡查找菌絲和孢子。

1.2.3 蘇木素染色查找真菌 取適量角膜潰瘍刮取物涂片于載玻片上，滴加蘇木素20 μl，盡量將刮取物薄層鋪開(kāi)，蓋上蓋玻片，放置5 min染色，顯微鏡下先用低倍鏡找到標(biāo)本位置，再用高倍鏡查找菌絲和孢子。

1.2.4 真菌培養(yǎng) 取適量角膜潰瘍刮取物接種于沙氏培養(yǎng)基試管，斜面朝上，25℃溫箱孵育培養(yǎng)3～21 d，觀察有無(wú)真菌生長(zhǎng)，根據(jù)菌落的外觀、生長(zhǎng)速度、菌絲、孢子或菌細(xì)胞形態(tài)特征等進(jìn)行菌種鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以真菌培養(yǎng)結(jié)果作為確診真菌性角膜炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”。計(jì)算蘇木素染色法和KOH濕片法查找真菌的陽(yáng)性率、靈敏度、特異度、假陽(yáng)性率、假陰性率、正確指數(shù)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。

2 結(jié)果

KOH濕片法真菌菌絲顯示為近透明條索狀結(jié)構(gòu)，與背景對(duì)比度差(圖1-A)。蘇木素染色后真菌菌絲顯示為藍(lán)色管腔狀結(jié)構(gòu)，與背景對(duì)比度強(qiáng)(圖1-B)。59例真菌性角膜炎病例中47例檢出真菌，陽(yáng)性率79.66%。蘇木素染色法查找真菌陽(yáng)性率64.40%，靈敏度74.46%，特異度42.86%，假陽(yáng)性率25.00%，假陰性率25.53%，正確指數(shù)17.32%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值92.11%，陰性預(yù)測(cè)值42.85%。KOH濕片法查找真菌陽(yáng)性率45.76%，靈敏度 44.68%，特異度 18.75%，假陽(yáng)性率50.00%，假陰性率55.32%，正確指數(shù)-36.57%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值77.78%，陰性預(yù)測(cè)值18.75%。

圖1 涂片查找真菌(100，A:KOH濕片法，B:蘇木素染色法)

3 討論

真菌性角膜炎是嚴(yán)重的致盲眼病，早期診斷、早期治療對(duì)視力預(yù)后有決定性的影響。真菌性角膜炎的確診需依靠實(shí)驗(yàn)室檢查［4］。本研究發(fā)現(xiàn)蘇木素染色法查找真菌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性率、正確指數(shù)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均高于KOH濕片法;蘇木素染色法查找真菌的假陽(yáng)性率、假陰性率均低于KOH濕片法。診斷試驗(yàn)的真實(shí)性包括靈敏度和特異度。靈敏度即真陽(yáng)性率，指的是診斷試驗(yàn)?zāi)軐?shí)際患病的病例正確地判斷為患病的能力。特異度即真陰性率，是指診斷試驗(yàn)?zāi)軐?shí)際未患某病的病例正確地判斷為未患病的能力。正確指數(shù)(約登指數(shù))=靈敏度+特異度-1。靈敏度、特異度越高，診斷試驗(yàn)的正確指數(shù)愈高，則該試驗(yàn)的真實(shí)性愈高。本研究發(fā)現(xiàn)蘇木素染色法查找真菌的靈敏度、特異度和正確指數(shù)均高于KOH濕片法查找真菌，這說(shuō)明蘇木素染色法查找真菌的真實(shí)性更高。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是指診斷試驗(yàn)陽(yáng)性的病例中真陽(yáng)性的比例;陰性預(yù)測(cè)值是指試驗(yàn)陰性的病例中真陰性的比例。研究人群患病率水平對(duì)診斷試驗(yàn)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的影響卻很大。本研究人群為臨床診斷真菌性角膜炎病例，這屬高危人群，診斷試驗(yàn)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高。本研究發(fā)現(xiàn)蘇木素染色法查找真菌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于KOH濕片法查找真菌，達(dá)92.11%。這說(shuō)明蘇木素染色法查找真菌陽(yáng)性的病例患真菌性角膜炎的可能性很大，這可用于指導(dǎo)臨床早期治療。假陽(yáng)性率指診斷試驗(yàn)將實(shí)際未患病的病例錯(cuò)誤判斷為患病的能力，即為誤診率。假陰性率是指診斷試驗(yàn)將實(shí)際患病的病例錯(cuò)誤判斷為無(wú)病的能力，即為漏診率。本研究發(fā)現(xiàn)蘇木素染色法查找真菌的假陽(yáng)性率、假陰性率均低于KOH濕片法查找真菌。這說(shuō)明蘇木素染色法查找真菌的誤診率和漏診率均較低。

蘇木素是臨床病理最常用的染色劑之一，價(jià)格便宜，易于獲得。蘇木素是從洋蘇木中提取的一種染色劑，能夠在使細(xì)胞核染色。蘇木素為紫色液體，可將菌絲、孢子染色紫色，增強(qiáng)與背景的對(duì)比度，使菌絲和孢子易于被檢出，從而提高了診斷試驗(yàn)的靈敏度、陽(yáng)性率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值;且染色后的菌絲與角膜纖維、雜質(zhì)易于區(qū)分，提高了診斷試驗(yàn)的特異生、陰性預(yù)測(cè)值。

影響真菌涂片檢出率的因素。①蘇木素染液蘇木素染液久置后會(huì)產(chǎn)生沉淀，過(guò)濾后染色，這可減少由于染液沉淀造成假陽(yáng)性的出現(xiàn)，減低誤診率。②標(biāo)本采集當(dāng)刮片中真菌數(shù)量少時(shí)，蘇木素染色檢出率就下降［4-5］。由于真菌生長(zhǎng)多位于潰瘍周邊部及底部，但潰瘍中央的白色粘性物質(zhì)往往是菌絲叢，角膜標(biāo)本少，采集的標(biāo)本時(shí)連潰瘍中央的白色粘性物質(zhì)一起采聚后直接涂片可提高真菌涂片的檢出率。③涂片過(guò)厚涂片過(guò)厚時(shí)，標(biāo)本重疊不利于鏡下觀察判斷，涂片標(biāo)本應(yīng)在染色液中盡量分散開(kāi)，必要時(shí)在蓋玻片上加壓促進(jìn)團(tuán)塊狀物質(zhì)分散。

隨著角膜接觸鏡的普及以及廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑的廣泛使用，真菌性角膜炎的發(fā)病率不斷增高。真菌性角膜炎早期、快速、有效的診斷方法是目前研究的熱點(diǎn)［1，2，4］。激光共焦顯微鏡和PCR技術(shù)在真菌性角膜炎診斷領(lǐng)域中展示了良好的應(yīng)用前景，但其價(jià)格昂貴，目前還不能普及應(yīng)用［6-8］，且有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。蘇木素染色法價(jià)格便宜，查找真菌幾分鐘便可出結(jié)果，靈敏度高，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高，是真菌性角膜炎早期診斷簡(jiǎn)單、快速、有效的方法。

［1］ Jurkunas U，Behlau I，Colby K.Fungal keratitis:changing pathogens and risk factors.Cornea，2009，28(6):638-643.

［2］ 王麗婭.我國(guó)真菌性角膜炎的研究現(xiàn)狀.眼科，2005，14(3):143-144.

［3］ Das S，Sharma S，Kar S，et al.Is inclusion of Sabouraud dextrose agar essential for the laboratory diagnosis of fungal keratitis?Indian J Ophthalmol，2010，58(4):281-286.

［4］ Nayak N.Fungal infections of the eye-laboratory diagnosis and treatment.Nepal Med Coll J，2008，10(1):48-63.

［5］ Bashir G，Shah A，Thokar MA，et al.Bacterial and fungal profile of corneal ulcers-a prospective study.Indian J Pathol Microbiol，2005，48(2):273-277.

［6］ Menassa N，Bosshard PP，Kaufmann C，et al.Rapid detection of fungal keratitis with DNA-stabilizing FTA filter paper.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(4):1905-10.

［7］ Avunduk AM，Beuerman RW，Varnell ED，et al.Confocal microscopy of Aspergillus fumigatus keratitis.Br J Ophthalmol，2003，87(4):409-410.

［8］ 謝立信，李紹偉，史偉云.共焦顯微鏡在真菌性角膜炎臨床診斷中的應(yīng)用.中華眼科雜志，1999，35(1):7-9.