犬肝纖維化MR彌散加權(quán)成像及VEGF表達(dá)與病理對(duì)照研究

章雅琴，李從蕊，胡躍群，駱 雷，廖云杰，王 維

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。肝纖維化的早期診斷及嚴(yán)重程度判定在慢性肝病的早期治療和預(yù)后判斷中有重要意義。以小動(dòng)物如鼠、兔等為主的肝纖維化模型，肝臟體積小，耐受力差，死亡率高；且成模時(shí)間短，多在12～18周左右，與人類慢性肝病的致病過(guò)程有一定差別。在基于小動(dòng)物模型肝纖維化形態(tài)學(xué)的傳統(tǒng)影像方法研究中，未發(fā)現(xiàn)比較敏感和特異的指標(biāo)。

本研究擬利用中華田園犬模型模擬人慢性肝纖維化過(guò)程，在建立肝纖維化的過(guò)程中，動(dòng)態(tài)進(jìn)行肝臟DWI成像、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)檢測(cè)并與常規(guī)病理結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行對(duì)照分析；在肝纖維化動(dòng)態(tài)改變過(guò)程中，從分子水平對(duì)其結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)評(píng)價(jià)肝纖維化的指標(biāo)進(jìn)行探索，以期提高肝纖維化的影像診斷水平。

本實(shí)驗(yàn)符合科學(xué)技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的要求[1]，已經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)同意。

1 材料與方法

1.1 犬肝纖維化模型的制備

健康雄性中華田園犬，12只，體重9～12 kg，24月齡，普通喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組10只，對(duì)照組2只。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射50% CCl4植物油混合劑，注射劑量按0.125 ml/kg體重，每周2次；6月后根據(jù)動(dòng)物的飲食、體重反應(yīng)情況，劑量調(diào)整為0.15 ml/kg；高脂低蛋白喂養(yǎng)，以自來(lái)水為飲料。對(duì)照組采用普通喂養(yǎng)，腹腔注射相同劑量的生理鹽水，每周2次。每4周行MR掃描及肝穿刺活檢1次，共獲得48組動(dòng)物肝臟與病理對(duì)照的資料。

1.2 MR掃描方法及圖像后處理

采用德國(guó)西門(mén)子公司的Siemens Magnetom Avanto 1.5 T超導(dǎo)型磁共振成像儀，體部相控陣線圈，于掃描前30分鐘肌肉注射3%戊巴比妥鈉(1～1.5 ml/kg體重)將動(dòng)物麻醉，取左側(cè)臥位，用腹帶加壓腹部，腹、背側(cè)各放一沙袋固定，將肝臟置于線圈中心。常規(guī)T1WI、T2WI掃描，DWI采用單次激發(fā)平面回波成像序列，彌散敏感梯度b值取800 s/mm2，具體參數(shù)：TR=6400 ms，TE=105 ms, 矩陣192×160，層厚5.0 mm，層間距0 mm， FOV 168 mm×283 mm，激勵(lì)次數(shù)(NSA)1次。

常規(guī)T1WI、T2WI掃描圖像：觀察肝臟大小、形態(tài)、邊緣、各葉比例，肝實(shí)質(zhì)信號(hào)均勻度，脾臟大小的改變，有無(wú)腹水。

DWI圖像：使用磁共振儀配套計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行后處理，軟件自動(dòng)產(chǎn)生ADC偽彩圖。利用ROI技術(shù)在ADC圖像上測(cè)得肝臟表觀彌散系數(shù)(ADC)。ROI為手工畫(huà)出，面積100～200 mm2，同時(shí)避免靠近肝臟邊緣、避開(kāi)大血管、膽管及偽影，ROI應(yīng)大于100個(gè)像素。選取3個(gè)不同層面，每個(gè)層面取3個(gè)肝臟感興趣區(qū)(肝左葉1個(gè)，肝右葉2個(gè))，將9個(gè)測(cè)得值取算數(shù)平均值，作為肝臟ADC值；并計(jì)算相應(yīng)感興趣區(qū)的指數(shù)表觀彌散系數(shù)(eADC值)。ADC值與eADC值的計(jì)算公式為：ADC=In(S低/S高)/(b高-b低)，eADC=S高/S低。S高為b高=800 s/mm2時(shí)的DWI圖像上肝臟的信號(hào)值。S低為b低=0 s/mm2時(shí)肝臟的信號(hào)值。In為自然對(duì)數(shù)。由ADC值與eADC值計(jì)算公式可推導(dǎo)出：eADC=e-b*ADC。

1.3 肝臟組織病理學(xué)

每次MR掃描結(jié)束后立即通過(guò)超聲引導(dǎo)下穿刺取得肝組織，病理取材盡量與MR中ROI設(shè)置層面相對(duì)應(yīng)，并用10%福爾馬林溶液固定，48 h內(nèi)石蠟包埋做成4 μm連續(xù)切片，按常規(guī)程序進(jìn)行HE染色、Masson染色及VEGF免疫組織化學(xué)染色。

肝纖維化分期采用如下標(biāo)準(zhǔn)[2]：0期：無(wú)纖維化；1期：匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局限于竇周和小葉內(nèi)纖維化；2期：匯管區(qū)周?chē)w維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；3期：纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化；4期：假小葉形成，早期肝硬化。

VEGF判定標(biāo)準(zhǔn)參照Park等[3]的方法：先用低倍鏡(40倍)觀察整個(gè)切片，選定VEGF染色最強(qiáng)處，然后在200倍光鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性染色細(xì)胞＜5%為陰性(-)；5%～50%為陽(yáng)性(+)；＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件包，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

所有計(jì)量資料用mean±S表示，ADC值及eADC值與肝纖維化程度的相關(guān)性，用Spearman相關(guān)分析；ADC值及eADC值在不同程度纖維化分期間差異，先采用單因素方差分析，存在顯著性差異，再用LSD法進(jìn)行多重比較。

VEGF的表達(dá)以等級(jí)形式表示：陰性(-)、陽(yáng)性(+)、強(qiáng)陽(yáng)性(++)。采用秩和檢驗(yàn)其在肝纖維化各期中的表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果

2.1 肝臟大體標(biāo)本改變

動(dòng)物制模周期為1年，實(shí)驗(yàn)終止后的大體病理顯示：肝臟質(zhì)地變硬，失去光澤，邊緣圓鈍；肉眼觀：肝臟表面凹凸不平，呈小結(jié)節(jié)狀(圖1)。

2.2 MR-DWI肝臟形態(tài)影像表現(xiàn)與病理對(duì)照

圖2 正常犬肝臟MR成像及病理組圖。正常犬肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整；未見(jiàn)明顯膠原組織沉積；未見(jiàn)明顯VEGF陽(yáng)性著色細(xì)胞；MRI示肝臟大小、形態(tài)正常，邊緣光滑銳利，實(shí)質(zhì)信號(hào)均勻。2A：Masson染色100倍；2B：VEGF染色 100倍；2C：T2WI；2D：DWI圖像；2E：ADC圖Fig 2 The liver of normal dog MRI and pathology. In the control group, the structure of liver lobule is normal, no signi fi cant collagen deposition; no signi fi cant VEGF positive cells; The size and morphology of liver are normal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組活檢標(biāo)本病理顯示：纖維化程度逐漸加重，肝臟匯管區(qū)、中央靜脈周?chē)案胃]壁纖維沉積增多并向外延伸，逐漸形成纖維間隔，進(jìn)而肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，形成假小葉，出現(xiàn)早期肝硬化，各期肝纖維化模型：S0 (n=10)、S1 (n=9)、S2 (n=9)、S3(n=10)、S4 (n=10)，見(jiàn)表1；同時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平亦呈逐漸增高趨勢(shì)(表2)；但是MR-DWI肉眼觀肝臟大小、形態(tài)及各葉比例未見(jiàn)明顯異常，形態(tài)學(xué)不能顯示出正常肝臟與纖維化肝臟之間的差別(圖2～6)。

圖3 肝纖維化S1期犬肝臟MRI成像及病理組圖。肝纖維化S1期匯管區(qū)可見(jiàn)輕度增生的膠原纖維；可見(jiàn)散在VEGF陽(yáng)性著色細(xì)胞；MRI示肝臟大小、形態(tài)未見(jiàn)異常，邊緣光滑銳利，實(shí)質(zhì)信號(hào)均勻。3A：Masson染色100倍；3B：VEGF染色100倍；3C：T2WI；3D：DWI圖像；3E：ADC圖Fig 3 Liver fi brosis-S1 MR imaging and pathology. Fibrosis-S1 a few of collagen fibers located in portal area; A few VEGF positive cells; the size and shape are abnormal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

表1 實(shí)驗(yàn)組制模不同時(shí)期肝纖維化程度對(duì)照表Tab 1 Comparsion liver fi brosis of the experimental group in different stage of molding

圖4 肝纖維化S2期犬肝臟MRI成像及病理組圖。肝纖維化S2期膠原纖維向小葉內(nèi)延伸，但小葉結(jié)構(gòu)仍保持完整；VEGF陽(yáng)性著色細(xì)胞增多；MRI示肝臟大小、形態(tài)未見(jiàn)異常，邊緣光滑銳利，實(shí)質(zhì)信號(hào)均勻。4A：Masson染色200倍；4B：VEGF染色100倍；4C：T2WI；4D：DWI圖像；4E：ADC圖Fig 4 Liver fibrosis-S2 MR imaging and pathology. Fibrosis-S2 collagen fibers extend to the lobules, but the structure of liver lobule is still intact;VEGF positive cells increased; The size and shape are abnormal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

圖6 肝纖維化S4期MRI成像及病理組圖。肝纖維化S4期匯管區(qū)、肝竇壁、中央靜脈周?chē)案涡∪~內(nèi)可見(jiàn)明顯纖維化，部分假小葉形成，出現(xiàn)早期肝硬化改變；纖維帶內(nèi)異型增生肝細(xì)胞及血管腔內(nèi)容物VEGF強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。MRDWI肝臟大小、形態(tài)未見(jiàn)異常，邊緣光滑銳利，實(shí)質(zhì)信號(hào)均勻。6A：Masson染色100倍；6B：VEGF染色100倍；6C：T2WI；6D：DWI圖像；6E：ADC圖Fig 6 Liver fi brosis-S4 MR imaging and pathology. Fibrosis-S4,around portal area, walls of sinusoids, central veins and the liver lobules are significant fibrotic, some pseudo-lobule formation;Strong positive expression of VEGF is much in the the fi ber band and vascular lumen. The size and shape are abnormal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

圖5 肝纖維化S3期犬肝臟MRI成像及病理組圖。肝纖維化S3期肝臟淤血，肝細(xì)胞腫脹，膠原纖維明顯向小葉內(nèi)延伸形成纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂；VEGF陽(yáng)性著色細(xì)胞明顯增多呈陽(yáng)性表達(dá)，以纖維帶內(nèi)顯著；MR-DWI肝臟大小、形態(tài)未見(jiàn)異常，邊緣光滑銳利，實(shí)質(zhì)信號(hào)均勻。5A：Masson染色100倍；5B：VEGF染色200倍；5C：T2WI；5D：DWI圖像；5E：ADC圖Fig 5 Liver fi brosis-S3 MR imaging and pathology. Fibrosis-S3, liver congestion, liver cell swelling, collagen fibers is significantly extented to the lobular, fibrous septa is formed; Lobules of liver is disorder; VEGF positive cells are significantly increased, especially in the fiber band; the size and shape are abnormal,smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

表2 犬肝纖維化各期VEGF表達(dá)水平對(duì)照表Tab 2 Comparsion liver fi brosis stages of VEGF expression

2.3 DWI ADC值與EADC值與肝纖維化程度的關(guān)系

隨肝纖維化程度加重，ADC值逐漸減低，eADC值依次增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3，ADC值與肝纖維化程度顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)；EADC值與肝纖維化程度顯著正相關(guān)(P＜0.01)，見(jiàn)表4。

2.4 ADC值與EADC值在肝纖維化診斷中的價(jià)值

將ADC值的1100或eADC值的0.42視為診斷肝纖維化的閾值，則ADC值區(qū)分正常肝臟與肝纖維化的特異性為90%，敏感性為97.4%；EADC區(qū)分正常肝臟與纖維化的特異性為81.8%，敏感性為99.3%，見(jiàn)表5。

表3 不同程度纖維化分期組間ADC值、eADC值結(jié)果Tab 3 The results of ADC values and eADC values in varying degrees of fi brosis

表4 ADC值、eADC值與纖維化程度的相關(guān)性Tab 4 The correlation between ADC values (eADC values)and fi brosis

表5 ADC值與EADC值在肝纖維化診斷中的價(jià)值Tab 5 Diagnostic value of ADC values and eADC values in hepatic fi brosis

3 討論

3.1 肝纖維化動(dòng)物模型的制備

目前文獻(xiàn)中所選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多以小動(dòng)物如鼠、兔等為主，但鼠、兔肝臟體積小，耐受力差，死亡率高；且成模時(shí)間短，多在12～18周左右，不符合人類慢性肝病的致病過(guò)程。本研究選用犬作為肝纖維化動(dòng)物模型，相對(duì)嚙齒類小動(dòng)物，其飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，生命力強(qiáng)，肝臟體積大，有利于影像學(xué)觀察及肝穿病理檢測(cè)，從而可以對(duì)肝纖維化進(jìn)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察與評(píng)估。另外本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射小劑量、低濃度的CCl4植物油溶液，配合高脂低蛋白飲食的制模方法，雖制模周期長(zhǎng)，但肝纖維化進(jìn)展穩(wěn)定，模擬了從肝細(xì)胞變性-肝纖維化-早期肝硬化的全過(guò)程，更接近人類慢性肝病的發(fā)生，同時(shí)降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率，且成活時(shí)間長(zhǎng)，便于動(dòng)態(tài)觀察肝纖維化進(jìn)展，并獲得纖維化各期模型，有利于進(jìn)一步研究肝纖維化病理與影像學(xué)的相關(guān)改變。

3.2 DWI對(duì)肝纖維化的診斷價(jià)值

DWI是基于組織內(nèi)水分子的彌散運(yùn)動(dòng)。機(jī)體內(nèi)水分子的運(yùn)動(dòng)會(huì)受到細(xì)胞膜及組織間質(zhì)中大分子的限制；而不同的組織結(jié)構(gòu)和分子環(huán)境對(duì)水分子熱運(yùn)動(dòng)的限制程度不同，DWI通過(guò)檢測(cè)機(jī)體組織內(nèi)水分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)來(lái)反映組織的結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)[4-5]。研究表明ADC值可以量化反映組織的病理變化[6-7]。但是肝纖維化及肝硬化對(duì)ADC值的影響還未取得一致的意見(jiàn)。大多數(shù)學(xué)者[8]研究認(rèn)為肝纖維化時(shí)由于細(xì)胞外間隙內(nèi)大量纖維組織彌漫性增生、沉積，限制了水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致ADC值減小。而楊正漢等[9]認(rèn)為ADC值降低的主要原因可能是因?yàn)槔w維組織的增生影響了肝臟微循環(huán)，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)內(nèi)血流灌注減少所致。不少國(guó)內(nèi)外學(xué)者[10-14]研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化時(shí)ADC值也較正常減低，肝纖維化程度增加與肝實(shí)質(zhì)ADC值的下降之間呈顯著負(fù)相關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)大動(dòng)物的慢性肝纖維化的動(dòng)態(tài)研究顯示，雖肝纖維化程度加重，但常規(guī)MR平掃未見(jiàn)肝臟大小、形態(tài)及信號(hào)異常，從形態(tài)學(xué)上不能顯示出正常肝臟與纖維化肝臟之間的差別。但通過(guò)DWI成像，隨著肝纖維化程度的加重，ADC值逐漸降低，EADC值逐漸升高；且不同程度纖維化組間ADC值、EADC值差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ADC值的大小與纖維化程度呈顯著負(fù)相關(guān)，EADC值的大小與纖維化程度呈顯著正相關(guān)。DWI參數(shù)可以對(duì)不同程度肝纖維化做定量分析，且其敏感性及特異性較高，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：將ADC值的1100或EADC值的0.42 為診斷肝纖維化的閾值，有一定價(jià)值。因此，ADC值及EADC值是不同程度纖維化較有意義的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)分析，肝纖維化時(shí)ADC值下降可能與下列因素有關(guān)：①由于細(xì)胞外間隙內(nèi)大量纖維組織彌漫性增生、沉積，限制了水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)；②增生紊亂的纖維組織影響了肝臟微循環(huán)，導(dǎo)致肝內(nèi)血流灌注減少；③肝纖維化過(guò)程中同時(shí)伴有肝細(xì)胞水腫變性、炎細(xì)胞增多亦限制水分子運(yùn)動(dòng)。

3.3 肝纖維化過(guò)程中VEGF的改變

VEGF與各種肝病的關(guān)系逐漸受到重視，其在各種肝病中的作用已被廣泛研究，并證實(shí)VEGF在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)肝細(xì)胞再生以及良、惡性肝病的發(fā)生發(fā)展均起重要作用。研究表明，肝細(xì)胞表達(dá)的血管生長(zhǎng)因子是肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵因素[15]。嚴(yán)家春等[16]研究認(rèn)為VEGF在肝內(nèi)血管增生、改建中起到關(guān)鍵作用,而肝內(nèi)微循環(huán)血管破壞、炎癥、阻塞及增生病變和肝竇毛細(xì)血管化，則是引起肝壞死、肝纖維化的最主要原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨肝纖維化程度加重血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平明顯增高。肝纖維化時(shí)肝內(nèi)血流灌注減少，氧分壓降低，缺氧導(dǎo)致VEGF的表達(dá)上調(diào)，VEGF誘導(dǎo)肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，有利于肝纖維化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DWI比傳統(tǒng)形態(tài)影像能更早地反映肝纖維化病變。隨肝纖維化程度加重，肝臟ADC值下降，eADC值升高，ADC值及eADC值與肝纖維化程度具有良好的相關(guān)性，提示DWI具有定量分析肝纖維化嚴(yán)重程度的能力。隨肝纖維化進(jìn)展，VEGF表達(dá)水平增高，因此調(diào)整VEGF的表達(dá)強(qiáng)度，改善肝組織血液淤積缺氧，是抗肝纖維化治療中亟待研究解決的重要課題。

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