杭白菊水提取物對犬急性心肌梗死后缺血心肌的保護(hù)作用

黃 浩 郭環(huán)宇 金紅峰 浙江醫(yī)院 杭州 310013

杭白菊（Dendranthema morifolium（Ramat.））是浙江馳名中外的地道藥材，為“浙八味”之一，有清熱、平肝、明目功能。根據(jù)報(bào)道，菊花水煎醇沉劑對離體和在體心臟有明顯的擴(kuò)張冠脈及增加冠脈流量的作用，并減慢心率，影響心肌收縮力[1]。但有關(guān)杭白菊對心肌缺血后炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制方面研究尚未見報(bào)道。我們采用在體犬急性心肌梗死模型，觀察杭白菊水提物對犬急性心肌梗死后炎癥因子IL-6和TNF-α濃度的影響，并進(jìn)一步研究杭白菊水提取物在保護(hù)缺血心肌方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 健康成年比格（Beagle）犬24只，雌雄不拘，體重是10～15kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物及試劑 杭白菊水提物：杭白菊由浙江桐鄉(xiāng)春發(fā)杭白菊制品廠提供，經(jīng)浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥研究室鑒定。杭白菊粉碎后，以15倍量蒸餾水，在90℃提取2次，每次1.5h，合并2次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，減壓、55℃以下濃縮至0.25g/mL，以藥典方法測得濃縮液pH為5.36，相對密度為1.04；以A1（NO3）3比色法測得總黃酮含量為11.7mg/mL。將上述溶液分裝、滅菌，冷藏待用。戊巴比妥鈉（上海第四化工廠進(jìn)口分裝，批號(hào)F20041216），肝素鈉（南京生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)000201），氯化三苯基四氮唑（Triphenyl tetrazolium chloride，TTC，Sigma公司，批號(hào)f20030102，用磷酸緩沖液（pH=7.4）配置成1%的梗死心肌染色孵育液，避光保存）。伊文思藍(lán)（E-vans blue，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)F20030122，用磷酸緩沖液（pH=7.4）配置成1%溶液），76%泛影葡胺（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)060203，稀釋成50%的注射液）。

1.3 主要器材 C型臂X光機(jī)（H5000，PHILIPS公司）；右冠狀動(dòng)脈造影導(dǎo)管，6F指引導(dǎo)管（6F Guiding Catheter）6F 鞘管（6F sheath，6F Dilator），2.5～3mm 球囊導(dǎo)管（PTCA Dilatation catheter），直徑 0.036cm 的導(dǎo)絲（0.014 inch Guide Wire）等（Cordis Corporation，USA）。栓子是聚乙烯泡沫（美國），經(jīng)過環(huán)氧乙烷消毒滅菌。

1.4 分組及給藥 24只比格（Beagle）犬隨機(jī)分為假手術(shù)組、急性心肌梗死模型組及杭白菊水提物低、高劑量組，每組6只。假手術(shù)組手術(shù)前以生理鹽水10mL/（kg·d）灌胃，只行冠脈造影，不做栓塞，術(shù)后普通喂養(yǎng)14天；急性心肌梗死模型組手術(shù)前以生理鹽水10mL（kg·d）灌胃，術(shù)后普通喂養(yǎng)14天；杭白菊水提物低劑量組手術(shù)前以生理鹽水10mL/（kg·d）灌胃，術(shù)后給予杭白菊水提物17mg/（kg·d）灌胃14天；杭白菊水提物高劑量組手術(shù)前以生理鹽水10mL/（kg·d）灌胃，術(shù)后給予杭白菊水提物68mg/（kg·d）灌胃14天。

1.5 急性心肌梗死模型建立[2]各組Beagle犬術(shù)前禁食12h，禁水4h，用3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于導(dǎo)管床上，分離頸總動(dòng)脈，經(jīng)頸總動(dòng)脈穿刺，實(shí)施冠狀動(dòng)脈介入術(shù)，以人工泡沫栓子封堵冠脈左前降支遠(yuǎn)端1/3處，術(shù)中進(jìn)行持續(xù)心電圖檢測。造模成功標(biāo)志：造影示球囊遠(yuǎn)端血流中斷；心電監(jiān)護(hù)出現(xiàn)ST段抬高，并且隨堵塞時(shí)間延長，ST段逐漸升高，與T波融合形成單向曲線。

1.6 標(biāo)本采集及檢測指標(biāo) 分別于冠脈栓塞前，栓塞后1h、2h、3h及杭白菊水提物干預(yù)2周后抽取靜脈血，測定血LDH、CK-MB、IL-6和TNF-α水平。心肌梗死面積測定采用EB/TTC雙染色法[2]。2周后放血處死動(dòng)物，迅速開胸取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈心臟各腔及表面血液，從主動(dòng)脈根部用注射器勻速推注1%伊文氏藍(lán)溶液。剔除左右心房、右心室、心臟瓣膜、腱索，保留左心室，用濾紙吸去水分，電子天平稱重。灌注區(qū)染為藍(lán)色，非灌注區(qū)不染色。小心將藍(lán)色區(qū)與未染色區(qū)分離。垂直于心臟長軸，自心尖向心底將左心室橫切成0.5cm厚的肌片，將未染色區(qū)置入1%TTC磷酸緩沖鹽溶液（pH7.4）中37℃恒溫孵育20min，則未染色區(qū)為梗死區(qū)，紅色區(qū)為未梗死區(qū)，紅色區(qū)和未染色區(qū)之和為缺血危險(xiǎn)區(qū)。冷生理鹽水沖去游離染料，吸紙瀝干，10%甲醛固定24h。以梗死區(qū)心肌占缺血危險(xiǎn)心肌重量和面積的百分比作為心肌梗死范圍的大小。梗死重量百分比（%）=（梗死區(qū)重量（g）÷危險(xiǎn)區(qū)重量（g））×100%。梗死面積百分比（%）=（梗死區(qū)面積（cm2）÷危險(xiǎn)區(qū)面積（cm2））×100%。

2 結(jié) 果

2.1 杭白菊水提物對犬急性心肌缺血引起的心肌梗死范圍的影響 與心肌梗死模型組比較，低、高劑量的杭白菊水提物組均可明顯降低心肌梗死范圍。杭白菊水提物高劑量組心肌重量/面積分別為模型對照組的31.0%和29.6%，杭白菊水提物低劑量組心肌重量/面積分別為模型對照組的49.3%和45.7%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表 1。

表1 各組犬心肌梗死情況比較（） %

表1 各組犬心肌梗死情況比較（） %

注：與模型組比較，**P＜0.01

組 別 n/只 梗死區(qū)重量 梗死區(qū)面積假手術(shù)組 6 0±0** 0±0**心肌梗死模型組 6 59.02±3.81 61.73±5.86低劑量杭白菊水提物組 6 29.12±4.82** 28.22±3.78**高劑量杭白菊水提物組 6 18.29±3.26** 18.24±4.42**

2.2 造模前后各組血清LDH和CK-MB濃度變化栓塞前各組血清LDH和CK-MB濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。約2h后四組血清LDH和CK-MB開始隨時(shí)間延長而增高，但假手術(shù)組雖有增高趨勢但無顯著性差異。與假手術(shù)組比較，2h后手術(shù)組犬LDH和CK-MB升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表 2、3。

表2 各組造模前后血清LDH濃度比較（） U/L

表2 各組造模前后血清LDH濃度比較（） U/L

注：與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01

組 別 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h假手術(shù)組 6 206.36±13.95 211.78±15.68 248.36±12.70 336.36±23.62心肌梗死模型組 6 209.36±17.85 214.35±44.13 522.43±29.10△△ 805.03±79.02△△低劑量杭白菊水提物組 6 210.66±25.11 205.82±29.04 547.24±29.50△△ 797.99±32.17△△高劑量杭白菊水提物組 6 214.54±28.66 208.62±25.67 518.72±47.28△△ 829.38±53.73△△

表3 造模前后各組血清CK-MB濃度比較（） U/mL

表3 造模前后各組血清CK-MB濃度比較（） U/mL

注：與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01

組 別 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h假手術(shù)組 6 10.98±1.77 10.64±2.57 16.79±2.06 24.79±4.03心肌梗死模型組 6 11.33±1.26 10.22±3.46 35.79±4.28△△ 55.33±7.11△△低劑量杭白菊水提物組 6 11.82±1.47 11.07±3.43 34.73±4.03△△ 59.28±2.18△△高劑量杭白菊水提物組 6 10.66±2.02 10.40±2.02 36.47±2.02△△ 56.77±3.61△△

2.3 犬急性心肌梗死后血清炎癥因子變化及杭白菊水提物的影響 心肌梗死各組栓塞后1、2、3h血清TNF-α、IL-6濃度顯著高于栓塞前基線水平，并均隨時(shí)間的延長而增高（P＜0.05，P＜0.01），2周后有所回落，但差異仍顯著高于栓塞前（P＜0.05）。與心肌梗死模型對照組比較，低、高劑量的杭白菊水提物組均可明顯降低栓塞后2周血清TNF-α、IL-6濃度，此作用呈濃度依賴性（P＜0.05，P＜0.01）,見表 4，5。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從活體動(dòng)物的水平證實(shí)了杭白菊水提物可明顯降低心肌急性缺血后炎癥因子TNF-α、IL-6水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，杭白菊能明顯減輕在體動(dòng)物的心肌缺血損傷，其機(jī)制與杭白菊水提物抑制炎癥反應(yīng)、延緩心肌細(xì)胞壞死和缺血組織重構(gòu)的作用有關(guān)。

表4 各組血清TNF-α 濃度比較（） pg/mL

表4 各組血清TNF-α 濃度比較（） pg/mL

注：與栓塞前比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h 2w假手術(shù)組 6 10.26±1.55 9.78±2.07 11.33±0.97 10.84±1.01 10.42±1.97心肌梗死模型組 6 10.73±1.85 14.22±1.13* 16.54±1.90** 22.03±1.02** 18.64±2.13**低劑量杭白菊水提物組 6 10.15±1.91 13.12±1.04* 15.94±1.50** 21.99±2.17** 15.46±1.17*△高劑量杭白菊水提物組 6 10.04±1.86 13.32±1.67* 16.02±2.28** 23.08±1.73** 12.82±2.05*△△

表5 各組血清IL-6濃度比較（） ng/L

表5 各組血清IL-6濃度比較（） ng/L

注：與栓塞前比較，**P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 n/只 栓塞前 栓塞后1h 2h 3h 2w假手術(shù)組 6 46.47±2.07 52.22±1.98 60.74±2.26 53.41±2.01 47.62±2.19心肌梗死模型組 6 49.02±2.46 68.72±1.28 117.24±5.60** 160.38±3.73** 88.62±1.67**△△低劑量杭白菊水提物組 6 50.47±1.85 62.24±2.10 120.39±4.12** 163.39±7.02** 121.13±4.13**高劑量杭白菊水提物組 6 48.65±2.11 67.24±2.50 124.46±4.28** 159.99±3.17** 109.82±2.04**△

當(dāng)心肌細(xì)胞由于缺血缺氧發(fā)生損傷、壞死時(shí)，其細(xì)胞膜完整性被破壞，細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)彌散至心臟間質(zhì)組織，并進(jìn)入梗死區(qū)的微血管和淋巴管，最后進(jìn)入血液循環(huán)，而在這些大分子物質(zhì)中，心肌特異性酶是細(xì)胞損傷的最佳標(biāo)志物[3]。血清肌酸磷酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）升高是檢測急性心肌梗死敏感指標(biāo)，目前多用血清肌酸磷酸激酶同工酶（CKMB）[4]。本實(shí)驗(yàn)中，CK-MB和LDH水平隨手術(shù)時(shí)間延長而升高，手術(shù)組在栓塞后2h開始有顯著性差異，說明心肌梗死模型成功，可排除假手術(shù)組手術(shù)創(chuàng)傷的影響。

據(jù)報(bào)道[5]，菊花水煎醇沉劑對離體和在位心臟有明顯的擴(kuò)張冠脈及增加冠脈流量的作用，該作用隨劑量增大而增強(qiáng)，并減慢心率，影響心肌收縮力。國外學(xué)者[6]研究發(fā)現(xiàn)從菊花中分離得到的三萜烯二醇、三醇及其相應(yīng)的棕櫚酸酯和肉豆蔻酸酯對由佛波酯（12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）誘發(fā)的小鼠耳水腫具有明顯的抗炎作用。而TPA是潛在促腫瘤劑，也是蛋白激酶 C（Proteinkinase C，PKC）激活劑，PKC的活化可促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和TGF-β等分泌增加，加重炎癥反應(yīng)和組織細(xì)胞損傷[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后血清TNF-α、IL-6濃度顯著高于栓塞前基線水平，并均隨時(shí)間的延長而增高，2周后有所回落，但差異仍顯著高于栓塞前（P＜0.05）。血TNF-α濃度在栓塞后1h已有明顯升高，較IL-6升高更為顯著。提示TNF-α、IL-6是心肌損傷的靈敏指標(biāo)，TNF-α較IL-6更敏感地反映了心肌缺血壞死的程度。杭白菊水提物低、高劑量組均有明顯降低栓塞后2周血清TNF-α和IL-6濃度的作用，此作用呈濃度依賴性。說明杭白菊可抑制TNF-α和IL-6的激活與分泌。

本實(shí)驗(yàn)觀察到不同劑量杭白菊水提物均有明顯降低心肌梗死重量/面積的作用，并可減少心肌梗死區(qū)域（P＜0.01）。說明杭白菊可以減少心肌組織的壞死，減少心肌重構(gòu)，具有保護(hù)缺血后心肌組織的作用。這種保護(hù)作用與抑制心肌缺血梗死后的炎癥反應(yīng)有關(guān)，可能通過抑制炎癥因子如TNF-α和IL-6的產(chǎn)生、聚集和釋放，而起到對缺血心肌的保護(hù)作用。

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