結(jié)石形成中骨橋蛋白與CD44的作用研究

于德君，孫衛(wèi)兵，楊 帆

(1.大連市第四人民醫(yī)院 外一科，遼寧 大連 116031；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 泌尿外科，遼寧 大連 116027)

泌尿系結(jié)石是人類(lèi)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，確切的病因不十分明確。結(jié)石成分以草酸鈣多見(jiàn)，占所有結(jié)石的75%，所以許多學(xué)者多以草酸鈣結(jié)石模型來(lái)研究成因。自上世紀(jì)三十年代提出Randall斑學(xué)說(shuō)以來(lái)，研究者們又陸續(xù)提出了多個(gè)學(xué)說(shuō)來(lái)探討結(jié)石的成因。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高濃度的草酸和/或一水草酸鈣(COM)結(jié)晶對(duì)腎小管上皮細(xì)胞有毒性作用，腎上皮細(xì)胞損傷是結(jié)石形成的最早期的基礎(chǔ)病變，是結(jié)石形成階段的必要條件之一[1-2]。草酸和草酸鈣結(jié)晶對(duì)腎細(xì)胞產(chǎn)生毒性后，會(huì)導(dǎo)致主要由腎臟產(chǎn)生并分泌到尿路中的大分子物質(zhì)，如骨橋蛋白(OPN)、TH蛋白、CD44、尿凝血酶片段-1等的基因和產(chǎn)物表達(dá)增加，它們能夠調(diào)節(jié)腎內(nèi)結(jié)晶的成核、生長(zhǎng)、聚集和滯留。而OPN與其受體CD44作用，能介導(dǎo)一系列細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的反應(yīng)，繼而引起吞噬了結(jié)石晶體的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)趨化運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致結(jié)石的形成[3]。但OPN在整個(gè)結(jié)石形成初期及后期的變化，與CD44的關(guān)系及是否為唯一的介導(dǎo)因子尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建高草酸尿癥大鼠的模型，對(duì)OPN和CD44在腎小管上皮細(xì)胞、基底膜和間質(zhì)處的表達(dá)進(jìn)行研究，探討OPN和CD44在結(jié)石形成過(guò)程中的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)性高草酸尿癥大鼠模型的構(gòu)建[4]

將35只雄性SD大鼠(200～250 g ，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分成7組，每組5只。對(duì)照組：以單蒸水和標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組(6組)：以含0.5%乙二醇和0.5%氯化氨的單蒸水為飲用水，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料分別喂養(yǎng)3、5、7、14、21、28 d。所有大鼠平均每只每天限水30 mL。

1.2 動(dòng)物模型的取材

常規(guī)處死大鼠，腹部正中剪開(kāi)腹壁和肌肉，打開(kāi)腹腔，上翻腸管及其他腎周臟器，暴露腎臟，無(wú)齒鑷分離腎周脂肪，血管鉗鉗夾腎蒂組織，眼科剪剪下雙側(cè)腎臟，迅速置于4 ℃ PBS溶液中。洗去血液，縱向剖開(kāi)腎臟，放入4%多聚甲醛溶液中固定保存。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 主要試劑：乙二醇、氯化氨(美國(guó)Alfa Aesar公司產(chǎn)品)；鈣鹽染色試劑盒，檸檬酸組織抗原修復(fù)液，濃縮型DAB試劑盒，磷酸鹽緩沖液粉劑，APES防脫片劑，快捷型酶標(biāo)山羊抗鼠/兔IgG聚合物(即用型MaxivisonTM試劑)(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；OPN小鼠抗大鼠單克隆抗，CD44兔抗大鼠多克隆抗體(上海越研生物科技有限公司美國(guó)RB公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品)。

1.3.2 主要儀器：切片機(jī)leica RM 2245，光學(xué)顯微鏡leica DMLP，自動(dòng)脫水機(jī)Leica TP1050(德國(guó)萊卡公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)箱(60 ℃)，數(shù)顯電熱恒溫水溫箱 PC-1000(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng))；電熱恒溫電熱箱(45 ℃)；DHP-9052 TP1050(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠(chǎng))；病理圖像分析系統(tǒng)(北京Medex公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HE染色，對(duì)腎小管管腔內(nèi)的結(jié)石晶體的觀察：(1)切片，二甲苯II級(jí)透明、脫蠟各10 min，梯度酒精水化切片；(2)蘇木素染色5 min、鹽酸酒精分色5～10 s，自來(lái)水沖洗各5 min，伊紅染料復(fù)染3～5 min；(3)梯度酒精脫水，二甲苯II級(jí)透明；(4)中性樹(shù)膠封片。

1.4.2 鈣鹽染色，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞基底膜和間質(zhì)的鈣鹽沉積情況的觀察：(1)切片，二甲苯II級(jí)透明、脫蠟各10 min，梯度酒精水化切片；(2)滴加1滴(100 μL)硝酸銀于切片上，置于強(qiáng)光下作用30 min后，蒸餾水洗5 min；(3)滴入1滴(100 μL)硫代硫酸鈉處理2 min，蘇木素襯染1 min，流水沖洗各10 min；(4)伊紅染色1 min，95%酒精洗滌分化，無(wú)水酒精脫水、透明；(5)中性樹(shù)膠封片。

1.4.3 免疫組化，對(duì)OPN和CD44表達(dá)情況的檢測(cè)：采用快捷免疫組化MaxivisonTM染色法，分別檢測(cè)各組標(biāo)本中OPN和CD44的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用己知陽(yáng)性組織切片做陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)指標(biāo)以PBS液代替一抗做陰性對(duì)照。

(1)切片：二甲苯II級(jí)透明、脫蠟各10 min，梯度酒精水化切片；(2)抗原熱修復(fù)：將切片置于已沸騰的檸檬酸組織抗原修復(fù)液的壓力鍋中，繼續(xù)加熱到噴汽后并持續(xù)90 s，自然冷卻至室溫后，用PBS沖洗3 min×3次；(3)每張玻片用3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；(4)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗，3 min×3次；(5)即用型MaxivisonTM試劑37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，3 min×3次；(6)DAB染色，避光，隨時(shí)顯微鏡觀察，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色，自來(lái)水、蒸餾水各沖洗1次；(7)復(fù)染:在蘇木素染色45～60 s，自來(lái)水沖洗，酒精分化2～3 s，EDTA返藍(lán)；(8)梯度酒精脫水透明，二甲苯透明；(9)中性樹(shù)膠封片。

1.5 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 腎小管管腔內(nèi)的草酸鈣結(jié)石晶體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]：按照文獻(xiàn)對(duì)腎小管管腔內(nèi)的草酸鈣結(jié)石晶體進(jìn)行評(píng)分，見(jiàn)表1。

表1 光鏡下腎小管管腔內(nèi)結(jié)石晶體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]

1.5.2 OPN和CD44的免疫組化結(jié)果判定

(1) OPN、CD44陽(yáng)性結(jié)果判斷: OPN為胞質(zhì)表達(dá),腎小管上皮細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色至深棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。CD44 為胞膜表達(dá),腎小管上皮細(xì)胞膜呈線(xiàn)狀棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。染色強(qiáng)度高于背景的非特異性染色判定為陽(yáng)性。

(2)實(shí)驗(yàn)指標(biāo): OPN、CD44陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度以灰度值作為衡量指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

(3)圖像分析:使用Medex彩色病理圖像分析儀分析圖像。具體方法如下:先在低倍鏡下(× 100)篩選出表達(dá)較強(qiáng)的區(qū)域，然后在這些區(qū)域中隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(× 400)測(cè)灰度值，然后取平均值?；叶戎涤髣t陽(yáng)性染色強(qiáng)度愈大。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)核實(shí)后，采用MATLAB2010b統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料比較用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson和Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腎小管管腔內(nèi)結(jié)石晶體的評(píng)分結(jié)果

光鏡下對(duì)各組腎小管管腔內(nèi)的結(jié)石晶體進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2，14 d組的評(píng)分高于其他各組(P<0.05) 。

表2 各組腎小管管腔內(nèi)的結(jié)石晶體評(píng)分

Tab 2 The grading of crystal stone of tubular lumen among rats of each group under light microscope

表2 各組腎小管管腔內(nèi)的結(jié)石晶體評(píng)分

1)與其他各組相比，P<0.05

組別動(dòng)物數(shù)量結(jié)石晶體評(píng)分對(duì)照組50.28±0.133 d組50.60±0.435 d組50.93±0.367 d組51.45±0.6214 d組5 3.85±0.931)21 d組52.11±0.5228 d組51.98±0.42

2.2 鈣鹽沉積情況

對(duì)照組、3、5 d組均未見(jiàn)明顯的鈣鹽沉積，而在7 d組出現(xiàn)了鈣鹽沉積，14 d明顯，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞基底膜和間質(zhì)中，見(jiàn)圖1。

圖1 14 d組 鈣鹽沉積 ×500

2.3 OPN在腎臟中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，腎髓袢處的OPN，在3 d組基本無(wú)表達(dá)，在5 d組有少許表達(dá)，在7 d組表達(dá)開(kāi)始明顯，在14 d組(圖2)明顯表達(dá)，在21 d組、 28 d組表達(dá)略下降,但仍明顯強(qiáng)于7 d組。其中，對(duì)照組、3 d組、5 d組、7 d組與14 d組比較，差異有顯著性意義 (P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖2 14 d組OPN在髓袢處的明顯表達(dá) ×500

2.4 CD44在腎臟中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，腎髓袢處的CD44在3 d組基本沒(méi)有表達(dá)，在5 d組有少許表達(dá)，在7 d組弱表達(dá)，而在14 d組明顯表達(dá)(圖3) ，21 d組和28 d組高表達(dá)。見(jiàn)表4。

表3 各組OPN的表達(dá)(灰度)

Tab 3 Comparison of OPN expression among rats of each group(gray)

表3 各組OPN的表達(dá)(灰度)

1)與14 d組相比，P<0.01；2)與14 d組相比，P<0.05

組別動(dòng)物數(shù)量灰度對(duì)照組58.95±1.361)3 d組514.68±3.281)5 d組520.82±4.702)7 d組525.52±5.962)14 d組535.73±9.3921 d組533.07±8.1728 d組528.04±7.51

圖3 14 d組 CD44在髓袢處明顯表達(dá) ×500

表4 各組CD44的表達(dá)(灰度)

2.5 OPN與CD44的相關(guān)性

分別用Pearson相關(guān)系數(shù)和Spearman秩相關(guān)系數(shù)來(lái)分析OPN與CD44的相關(guān)性。利用MATLAB2010b軟件進(jìn)行計(jì)算。OPN與CD44的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.8908，Spearman秩相關(guān)系數(shù)為0.8571。二者總體的相關(guān)性不是太明顯。將數(shù)據(jù)分段，前14 d的數(shù)據(jù)作為一組，后面的數(shù)據(jù)作為一組進(jìn)行分析。通過(guò)MATLAB軟件的計(jì)算，前14 d OPN與CD44的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.9887，Spearman秩相關(guān)系數(shù)為1；14 d以后OPN與CD44的Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.8191，Spearman秩相關(guān)系數(shù)為-1。前14 d OPN的灰度值隨著CD44灰度值的增加而增加；二者線(xiàn)性相關(guān)性很強(qiáng)，且呈正相關(guān)；14 d以后，隨著CD44灰度值的增加OPN的灰度值反而在減少，二者呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 OPN與CD44的灰度值對(duì)比

3 討 論

骨橋蛋白(OPN)是一種帶負(fù)電的非膠原性骨基質(zhì)磷酸化分泌性糖蛋白，廣泛存在于體液中，主要存在于骨組織，同時(shí)也參與了機(jī)體不同的病理生理反應(yīng)，如炎癥反應(yīng)，細(xì)胞存活，免疫應(yīng)答以及腫瘤的發(fā)生[6-7]。而CD44 是OPN 的受體，存在于固有的腎小球巨噬細(xì)胞，腎小球囊壁層上皮細(xì)胞，髓質(zhì)小管，偶爾存在于皮質(zhì)小管(髓袢粗支升段和遠(yuǎn)曲小管)中，在細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的信息傳遞過(guò)程中，在T細(xì)胞和單核細(xì)胞的激活、淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附以及腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的纖維化等過(guò)程中，發(fā)揮重要作用。

Khan等[8]發(fā)現(xiàn)結(jié)石大鼠腎臟中的OPN表達(dá)增加。有研究者在猴腎小管上皮細(xì)胞中加入草酸鈣晶體，OPN的含量及其基因的表達(dá)均明顯增加。諸多發(fā)現(xiàn)使OPN與結(jié)石形成的關(guān)系成為學(xué)者們研究的焦點(diǎn)，人們通過(guò)高草尿酸大鼠模型來(lái)進(jìn)行研究。

在實(shí)驗(yàn)性草酸鈣腎結(jié)石研究中，人們常用乙二醇+氯化氨溶液作為誘石劑。這種方法屬于慢性成石，具有穩(wěn)定的成模性與良好的重復(fù)性，用于雄性大鼠幾乎100%形成草酸鈣結(jié)石[4]。根據(jù)文獻(xiàn)資料，乙二醇飲水的濃度控制在0.5%～1%比較合適。本實(shí)驗(yàn)采用0.5%乙二醇+0.5%氯化氨方法進(jìn)行。7～21 d后在偏振光顯微鏡下觀察到結(jié)石大多位于髓質(zhì)處，與Randall斑常出現(xiàn)的部位相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)石形成的Randall斑學(xué)說(shuō)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組，隨著時(shí)間的推移，與對(duì)照組相比，腎臟組織水腫變脆，腎臟重量相對(duì)增加明顯，病理圖片顯示腎小管上皮細(xì)胞水腫甚至變性。通過(guò)鈣鹽染色，在偏振光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，大鼠腎髓袢中的鈣鹽沉積也逐漸增多，體積逐漸變大，7 d組的結(jié)石晶體明顯增加，14、21 d組達(dá)到最高。與此同時(shí)，OPN的表達(dá)也相應(yīng)明顯。鈣鹽沉積明顯的腎臟，免疫組化顯示OPN表達(dá)也明顯增強(qiáng)，鈣鹽沉積少的腎臟，OPN表達(dá)也弱。OPN的變化隨著結(jié)石的變化而變化，說(shuō)明OPN有可能參與了結(jié)石形成，但具體機(jī)制尚不能肯定。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)OPN可以抑制結(jié)石的形成。OPN基因缺失的大鼠，腎小管出現(xiàn)明顯的草酸鈣結(jié)石，而正常大鼠沒(méi)有結(jié)石形成[9-10]。以溶解狀態(tài)存在于尿液中的OPN，能抑制草酸鈣的粘附力[11]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)OPN可以促進(jìn)結(jié)石的形成。有研究發(fā)現(xiàn)加入OPN的MDCK細(xì)胞系粘附草酸鈣結(jié)晶的速度比不加的組別快1.4倍。而應(yīng)用抗OPN單克隆抗體或轉(zhuǎn)染OPN的反義鏈cDNA基因可顯著減少草酸鈣晶體對(duì)細(xì)胞的粘附[12]。有人研究表明，草酸鈣粘附力和聚集力的增加能導(dǎo)致結(jié)晶種植到表面含有OPN的膠原蛋白顆粒上。因此，表面固化的OPN能增加草酸鈣的粘附力。本實(shí)驗(yàn)中前14 d OPN表達(dá)逐漸增強(qiáng)，灰度值從3 d組的14.68±3.28，增強(qiáng)到14 d組的35.73±9.39；而對(duì)照組為8.95±1.36，這有可能是溶解狀態(tài)的OPN在抑制結(jié)石方面起作用。而實(shí)驗(yàn)中14 d后OPN表達(dá)逐漸減弱，灰度值降至28 d組的28.04±7.51，這有可能是OPN固化并參與了基質(zhì)構(gòu)成，從而加速了晶體的粘附聚集，促進(jìn)了結(jié)石的形成，因而表達(dá)減弱。

本研究發(fā)現(xiàn)，在某一時(shí)間段內(nèi)，OPN與CD44同步表達(dá)。3 d組OPN與CD44均無(wú)明確表達(dá)，但5 d組OPN與CD44已有少許表達(dá)在髓質(zhì)，OPN表達(dá)略強(qiáng)。14 d組OPN與CD44表達(dá)明顯增強(qiáng)。而在同一只實(shí)驗(yàn)大鼠中，OPN強(qiáng)表達(dá)的大鼠，CD44也強(qiáng)表達(dá)，通過(guò)相關(guān)性分析，OPN與CD44呈正相關(guān)。這表明可能OPN首先出現(xiàn)在受損的腎小管部位，繼而與巨噬細(xì)胞表面的CD44受體結(jié)合，趨化巨噬細(xì)胞到達(dá)受損部位。由于在人一水草酸鈣腎結(jié)石中，薄層條紋的有機(jī)質(zhì)中含有OPN，是腎結(jié)石的有機(jī)基質(zhì)成分之一，所以有理由相信，OPN參與了結(jié)石的形成。

OPN受體包括兩類(lèi)：integrin和CD44，是普遍存在的多結(jié)構(gòu)、多功能的跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞之間和細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。近年研究認(rèn)為，OPN是一種強(qiáng)大的巨噬細(xì)胞趨化因子和粘附因子。OPN經(jīng)凝血酶酶切以后，其N(xiāo)-末端片段能夠與巨噬細(xì)胞表面的CD44受體結(jié)合，對(duì)巨噬細(xì)胞具有趨化功能；而其C-末端片段則可與細(xì)胞表面的integrin受體αvβ1相互作用，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的粘附和遷移[13]。在局部缺血和中毒性損傷后的修復(fù)過(guò)程中，CD44和OPN在再生小管中被表達(dá)。這些證據(jù)表明，OPN和它的受體CD44的相互作用，也許參與了腎臟損害后的炎癥和修復(fù)過(guò)程，能夠?qū)Y(jié)石的形成產(chǎn)生影響。所以，當(dāng)OPN與CD44表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，二者的結(jié)合會(huì)趨化巨噬細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，通過(guò)巨噬細(xì)胞將結(jié)晶體吞噬、內(nèi)化或轉(zhuǎn)運(yùn)到其它地方，最終導(dǎo)致結(jié)石的形成[14]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，至14 d以后，OPN表達(dá)減弱，但CD44依然高表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)。這表明巨噬細(xì)胞可能依然作用在受損部位。有學(xué)者研究對(duì)于野生型大鼠，注射OPN、OPN酶切片段或MPC-3會(huì)引起大量的巨噬細(xì)胞聚集在實(shí)驗(yàn)部位；而對(duì)于CD44敲出鼠，注射OPN、OPN酶切片段卻沒(méi)有出現(xiàn)更多的巨噬細(xì)胞聚集，而注射MPC-3未對(duì)巨噬細(xì)胞聚集產(chǎn)生明顯影響[15]。這說(shuō)明，除了OPN通過(guò)與CD44的結(jié)合趨化巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)外，還有其他的因子參與了對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用。因此，當(dāng)OPN 參與了結(jié)石形成而表達(dá)減弱時(shí)，由于有MPC-3等因子對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用，所以巨噬細(xì)胞依然作用在受損部位，而位于巨噬細(xì)胞表面的CD44的表達(dá)依然比較明顯。

本研究結(jié)果提示，OPN和CD44表達(dá)與高草酸尿液狀態(tài)的結(jié)石形成關(guān)系密切，可能成為Randall斑的起源。

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