核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1、P27在大腸癌中的表達(dá)及意義

楊建華，王 蕾，周世廣，劉春海，瞿 峰，時志民，孫冬霞

(1. 邯鄲市中心醫(yī)院 病理科, 河北 邯鄲 056004；2. 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056002)

近年來，許多研究認(rèn)為腫瘤實際是一種細(xì)胞周期病，即細(xì)胞周期啟動、運(yùn)行和終止異常，細(xì)胞增殖過多，凋亡減少，腫瘤形成。在細(xì)胞周期中G1-S是控制細(xì)胞周期進(jìn)程的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因為在G1期中存在一限制點(restriction point，R點)。在R點之前，細(xì)胞周期的運(yùn)行依賴于細(xì)胞外生長因子，而一旦細(xì)胞周期跨過R點，細(xì)胞周期即為一自主性的過程，不再依賴于外界生長因子，所以G1-S對于細(xì)胞周期的運(yùn)行和完成是至關(guān)重要的[1-2]。其中，核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1、P27對調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期起著至關(guān)重要的作用。本研究采用免疫組化SP法檢測人大腸癌中E2F-1和P27的表達(dá)，探討兩者與大腸癌的臨床病理關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

收集選取2006年1月-2010年12月在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行大腸癌根治性切除經(jīng)病理確診的大腸癌78例，所有病例根治性手術(shù)前均未行化療或放療。78例患者中，男53例，女25例；年齡39～79歲，平均(59.3±20.3)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴轉(zhuǎn)移35例。按WHO分類標(biāo)準(zhǔn)(1996)進(jìn)行組織學(xué)分級：高分化24例，中分化24例，低分化30例。所有病例根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年修訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。同時取同期手術(shù)切除和結(jié)腸鏡活檢并經(jīng)病理確診的大腸腺瘤30例，另取癌旁10 cm以上正常大腸黏膜20例作為對照組。

1.2 方 法

試劑：兔抗人E2F-1多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology，鼠抗人單克隆抗體P27和即用型S-P試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司。

步驟：采用免疫組化SP法，玻片經(jīng)多聚賴氨酸行防脫片處理，微波抗原修復(fù)。染色過程按試劑盒說明操作。

1.3 結(jié)果判斷

切片免疫組化染色以已知陽性的肺癌為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。染色均以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，兩名病理醫(yī)生在顯微鏡下計數(shù)10個高倍視野，按陽性細(xì)胞所占百分比并參考著色強(qiáng)度分級如下：(-)：陽性細(xì)胞數(shù)<10%；(+)：陽性細(xì)胞數(shù)10%～24%；(++)：陽性細(xì)胞數(shù)25%以上。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，各組間比較用χ2檢驗，應(yīng)用非參數(shù)統(tǒng)計中Spearman等級相關(guān)對E2F-1和P27在大腸癌中表達(dá)的相互關(guān)系進(jìn)行分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 E2F-1和P27在大腸癌中的表達(dá)

E2F-1和P27陽性物質(zhì)分布于細(xì)胞核，見圖1、2。大腸癌E2F-1陽性表達(dá)率明顯高于正常大腸黏膜和大腸腺瘤(P<0.05)，正常大腸黏膜和大腸腺瘤E2F-1陽性表達(dá)率差異無顯著性意義(P>0.05)；P27在正常大腸黏膜中的陽性表達(dá)率明顯高于大腸腺瘤以及大腸癌，P27陽性表達(dá)在正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌之間差異具有顯著性意義(P<0.05)，見表1。

圖1 大腸腺癌中E2F-1呈細(xì)胞核陽性表達(dá) SP ×400

圖2 大腸腺癌中P27呈細(xì)胞核陽性表達(dá) SP ×400

表1 正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌中E2F-1、P27的表達(dá)

2.2 大腸癌組織中E2F-1和P27表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

在大腸癌組織中，E2F-1和P27的表達(dá)與患者的性別、年齡、大小無明顯相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。但E2F-1和P27表達(dá)與大腸癌的病理分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。且隨著病理分級、臨床分期的增高，E2F-1表達(dá)逐漸增高而P27表達(dá)降低，見表2。

2.3 大腸癌組織中E2F-1與P27表達(dá)的關(guān)系

對大腸癌組織中E2F-1與P27表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，E2F-1陽性表達(dá)的48例大腸癌中，2例P27陽性表達(dá),E2F-1與P27表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01,r= -0.393)。

表2 大腸癌組織中E2F-1、P27的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

大腸癌的發(fā)生是一個漸進(jìn)過程。它經(jīng)歷了正常大腸黏膜-上皮增生-腺瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級-不典型增生-原位癌-大腸癌-轉(zhuǎn)移的演進(jìn)過程。早期階段主要是細(xì)胞過度增生，進(jìn)一步發(fā)生細(xì)胞增生調(diào)控紊亂，最終導(dǎo)致早期癌和轉(zhuǎn)移，目前尚不清楚是哪些基因在腫瘤進(jìn)展的哪個階段發(fā)生突變或失調(diào)。但是，研究確定在G1期中存在一限制點(restriction point,R點)。一旦細(xì)胞周期跨過R點，細(xì)胞周期即為一自主性的過程，不再依賴于外界生長因子，所以G1-S對于細(xì)胞周期的運(yùn)行和完成至關(guān)重要[1-2]。其中，核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1對調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期起著至關(guān)重要的作用，轉(zhuǎn)錄因子E2F-1可與DP蛋白家族(DP1和DP2)結(jié)合形成異二聚體，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性；也可與Rb結(jié)合形成異二聚體，抑制其轉(zhuǎn)錄活性[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，E2F-1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了復(fù)雜的作用，起到癌基因或抑癌基因的作用。在食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌和涎腺腫瘤中均可見到E2F-1的過度表達(dá)[4-7]。在小細(xì)胞肺癌，E2F-1可以作為一種生長促進(jìn)因子，促進(jìn)腫瘤增殖，是預(yù)后不好的指標(biāo)[8]。但是，也有一些實驗結(jié)果卻表明[9-11]，E2F-1的過表達(dá)可以終止細(xì)胞的過度增生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到抑癌基因的作用[12]。

作者在對人大腸石蠟標(biāo)本研究中發(fā)現(xiàn)，E2F-1更多的表現(xiàn)為癌基因的作用。在正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌中E2F-1蛋白陽性表達(dá)逐漸增高。在大腸癌組中E2F-1蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于正常組和大腸腺瘤組。由此推斷在大腸癌的發(fā)生過程中，E2F-1過表達(dá)起到了促進(jìn)作用。同時，在大腸癌組織中，E2F-1陽性表達(dá)與大腸癌的組織分級、臨床病理分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。且隨著大腸癌組織分級和臨床病理分期增高，E2F-1表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，表明E2F-1的過表達(dá)在一定程度上可以反映大腸癌的生物學(xué)特性，其表達(dá)水平越高，腫瘤的侵襲力越強(qiáng)，惡性度就越高。

p27 是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 (cyclin - dependent kinase inhibitors,CKI)家族中的重要一員，是一種抑癌基因，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有該蛋白水平下降[13]。p27可直接抑制cyclin - CDK復(fù)合物的生物學(xué)活性，使細(xì)胞停滯于G1期，同時具有促進(jìn)細(xì)胞分化、介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及誘導(dǎo)凋亡等功能[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，P27從正常大腸黏膜到大腸腺瘤到大腸癌中表達(dá)逐漸下降，提示P27在大腸癌的發(fā)生中可能起重要作用。本實驗研究亦發(fā)現(xiàn)P27蛋白表達(dá)與大腸癌的分化程度、浸潤深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。P27蛋白水平在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤轉(zhuǎn)移時降低，提示P27蛋白表達(dá)率降低的大腸癌更易發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和肌層浸潤。故認(rèn)為P27低表達(dá)是大腸癌預(yù)后不良的一個獨立指標(biāo)。P27蛋白表達(dá)與腫瘤的惡性程度負(fù)相關(guān)，可能為P27的低表達(dá)時，對G1/ S期轉(zhuǎn)換的抑制作用減弱，使細(xì)胞更易進(jìn)入S期；P27表達(dá)能影響細(xì)胞間接觸，下調(diào)P27能抑制細(xì)胞粘附從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。

此外，本研究對E2F-1與P27相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在大腸癌中，E2F-1的高表達(dá)伴隨著P27低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)；也說明二者在大腸癌中分別起著癌基因和抑癌基因的作用。

總之，在大腸癌組織中E2F-1過度表達(dá)以及P27表達(dá)缺失，對大腸癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用,檢測E2F-1和P27在腫瘤組織中的表達(dá)情況可能成為評價腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

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