磷酸肌酸的腦保護(hù)作用研究

金 越，韓國(guó)柱，李 穎，馬郁芳，周 琴，孫慧君

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥理教研室，遼寧 大連，116044； 2. 大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 臨床藥理教研室，遼寧 大連 116044； 3.大連醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 遼寧 大連 116044)

腦組織代謝旺盛，血流量豐富，因此極易受到缺血缺氧的影響，引起神經(jīng)細(xì)胞功能的損害[1]。缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是由于腦部血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致以局部神經(jīng)功能損傷、缺失為特征的一組疾病[2]。該病死亡率高，并發(fā)癥和后遺癥多，嚴(yán)重危害人類健康，目前仍然缺乏有效的防治措施與理想藥物。

磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是人體內(nèi)自有的活性物質(zhì)，作為體內(nèi)能量?jī)?chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體，為ATP補(bǔ)充能量，維持機(jī)體進(jìn)行正常的活動(dòng)和代謝[3]。PCr于1927年由Eggleton 于哺乳動(dòng)物肌肉中分離得到，目前外源性PCr在臨床上主要作為心臟病的防治用藥之一廣泛用于心肌保護(hù)，但是其對(duì)腦損傷的保護(hù)作用以及機(jī)制研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本文主要通過(guò)建立小鼠腦缺血與腦缺血再灌注模型以及建立大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型來(lái)研究PCr對(duì)腦組織以及神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探討。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

PCr注射用無(wú)菌粉針劑，內(nèi)含磷酸肌酸鈉1g/支，哈爾濱博萊制藥有限公司惠贈(zèng)(批號(hào)070823，純度>97%)；肌酸由美國(guó)MERCK公司生產(chǎn)，純度≥99%。

Hyclone胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、二甲基四氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Gibco公司；Hyclone馬血清購(gòu)自Thremo公司；連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)購(gòu)自天津市化學(xué)試劑公司；LDH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；青霉素、鏈霉素購(gòu)自大連制藥廠；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與儀器

動(dòng)物與細(xì)胞株：昆明種小鼠共120只，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。儀器：3366型CO2培養(yǎng)箱，Thermo-354酶標(biāo)儀，XD-101倒置顯微鏡，80-1型低速離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦缺血小鼠生存時(shí)間以及腦組織MDA含量的測(cè)定：小鼠60只，體重20～30 g，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及藥物組。每組各20只。藥物組于造模前5 min緩慢尾靜脈推注PCr(10 mL/kg)，假手術(shù)組與模型組以同樣方法注射同等體積的生理鹽水。

小鼠腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)。麻醉后，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈。藥物組及模型組雙重置線結(jié)扎兩側(cè)血管，假手術(shù)組只在血管下置線并不結(jié)扎?？p合皮膚切口，將小鼠置于37 ℃恒溫環(huán)境加以護(hù)理。觀察動(dòng)物4 h內(nèi)反應(yīng)及死亡情況。

待小鼠瀕死時(shí)(小鼠呼吸<5 次/min視為瀕死)及手術(shù)后4 h記錄存活時(shí)間并在冰浴中活體斷頭取腦(去除嗅球及小腦組織)，在-70 ℃冰箱凍存待測(cè)。全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在冰浴中用預(yù)冷的生理鹽水將腦組織配制成20%腦勻漿，4 ℃ 3000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行MDA含量測(cè)定(硫代巴比妥酸比色法)。

1.3.2 腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的測(cè)定：小鼠60只，體重20～30 g，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組以及藥物組。每組20只。小鼠腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)，麻醉后，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈。藥物組緩慢尾靜脈推注PCr(10 mL/kg)，假手術(shù)組與模型組以同樣方法注射同等體積的生理鹽水。

給藥后8 min，藥物組及模型組分別夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組不夾閉動(dòng)脈。30 min后取下微型動(dòng)脈夾，再灌注30 min后立即冰浴中活體斷頭取腦(去除嗅球及小腦組織)，在-70 ℃冰箱凍存待測(cè)。MDA測(cè)定方法同上。

1.3.3 PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型MTT和LDH含量測(cè)定：PC12細(xì)胞用高糖DMEM完全培養(yǎng)基(內(nèi)含10%滅活胎牛血清、5%馬血清、青霉素/鏈霉素100 U/mL)置于37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況， 2～3 d換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞80%匯合或接近匯合成片后，用0.05%胰蛋白酶消化并用吸管輕輕吹打收集細(xì)胞，每周傳代2次。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，消化離心后用完全培養(yǎng)基重懸，密度為2×105個(gè)/mL，接種于96 孔板上。在37 ℃, 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用D-Hanks液輕輕蕩洗2次。

實(shí)驗(yàn)分為正常組，缺氧缺糖模型組，藥物組(PCr組以及肌酸組)。正常組細(xì)胞用含糖Earle’s液 (g/L) (NaCl 6.68，KCl 0.04，CaCl20.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaHCO32.2，NaH2PO4·2H2O 0.4，HEPES 2.4，葡萄糖0.2，pH 7.4) 培養(yǎng)。模型組細(xì)胞用含4 mmol/L Na2S2O4的無(wú)糖Earle’s液(配置方法同上，但不加葡萄糖)進(jìn)行培養(yǎng)(各損傷小組的Na2S2O4的濃度分別為0.5、1、2、4、8 mmol/L)。藥物組細(xì)胞用含4 mmol/L Na2S2O4以及不同濃度藥物的無(wú)糖Earle’s液進(jìn)行培養(yǎng)，藥物終濃度分別為20、15、10、8、5、1 mmol/L。將培養(yǎng)板置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后回收上清液，并加無(wú)血清高糖DMEM液100 μL/孔，MTT(終濃度0.5 mg/mL) 10 μL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入三聯(lián)液(10%SDS，5%異丙醇，0.012 mol/L HCl)100 μL/孔，待紫色結(jié)晶完全溶解后，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。藥物抑制率=(A藥物組-A模型組) /(A正常組-A模型組) ×100%。用LDH試劑盒測(cè)定上清液中LDH的釋放量，測(cè)定方法依照LDH試劑盒說(shuō)明書上操作，于440 nm處測(cè)定A值。LDH含量按公式計(jì)算：LDH (U/L)=(A測(cè)定-A測(cè)定空白) /(A標(biāo)準(zhǔn)-A標(biāo)準(zhǔn)空白) ×2000。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PCr對(duì)腦缺血小鼠生存時(shí)間以及腦組織MDA含量的影響

藥物組小鼠與模型組小鼠相比存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，腦組織MDA含量下降，其小鼠腦組織MDA水平與模型組相比差異具有顯著性意義，P<0.05。見(jiàn)表1。

2.2 PCr對(duì)腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響

如表1所示，在缺血再灌注模型中，藥物組小鼠腦組織MDA含量下降，與模型組小鼠腦組織MDA的水平相比差異具有顯著性意義，P<0.05。

表1 PCr對(duì)腦缺血小鼠生存時(shí)間及對(duì)腦缺血/腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響

2.3 PCr對(duì)PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型的影響

2.3.1 Na2S2O4致PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷作用

Na2S2O4濃度為 1、2、4及8 mmol/L時(shí)的損傷程度與正常組相比，差異有顯著性意義。見(jiàn)表2。細(xì)胞培養(yǎng)液中的Na2S2O4濃度達(dá)到4 mmol/L及以上時(shí)，MTT法測(cè)得的細(xì)胞存活率顯著降低，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH 釋放量顯著上升，故確定4 mmol/L Na2S2O4為實(shí)驗(yàn)所用的損傷濃度。

表2 不同濃度Na2S2O4對(duì)PC12細(xì)胞損傷作用的比較

2.3.2 PCr和肌酸對(duì)PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用

由表3可見(jiàn)，與模型組比較，PCr和肌酸組隨藥物濃度的增加，Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷有所減輕，細(xì)胞存活率明顯提高，受損細(xì)胞LDH的釋放受到抑制。從藥物終濃度為5 mmol/L開(kāi)始，藥物組與模型組相比差異有顯著性意義。藥物終濃度至10 mmol/L時(shí)，對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)產(chǎn)生的缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用達(dá)到高峰，繼續(xù)增加藥物濃度其保護(hù)作用沒(méi)有顯著增加。各濃度的PCr與相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照藥肌酸相比，差異無(wú)顯著性意義。

表3 PCr以及肌酸對(duì)缺氧缺糖細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

3 討 論

能量代謝障礙是腦缺氧缺血后最早產(chǎn)生的病理生理改變，隨后產(chǎn)生大量自由基并引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使神經(jīng)細(xì)胞趨向死亡[4]。腦組織缺氧缺血時(shí)能夠產(chǎn)生大量的氧自由基；此外，腦細(xì)胞神經(jīng)元富含對(duì)氧自由基敏感的多不飽和脂肪酸而抗氧化的物質(zhì)相對(duì)缺乏，因此極易受到自由基的侵襲傷害[5-6]，以上正是ICVD 的發(fā)病基礎(chǔ)。

興奮性毒素—谷氨酸的過(guò)度釋放是導(dǎo)致缺血缺氧性腦損傷的重要機(jī)制之一。由于谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，所以過(guò)量的情況下作用于NMDA受體和非NMDA受體，可引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載并激活鈣依賴的各種酶，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)；鈣超載又會(huì)生成大量的ROS，促進(jìn)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，最終造成神經(jīng)元退變壞死或遲發(fā)性死亡[7]。

PCr是人體中一種高能儲(chǔ)存物質(zhì)，通過(guò)“肌酸穿梭”的機(jī)制來(lái)完成線粒體氧化磷酸化生成ATP，目前在國(guó)內(nèi)外已被廣泛用做心臟病的防治用藥之一[8-11]。腦缺血后,能量衰竭主要表現(xiàn)在高能磷酸化合物ATP、PCr的耗竭上。在缺血缺氧初期，氧化磷酸化不能正常進(jìn)行，ATP減少，糖無(wú)氧酵解的關(guān)鍵酶——磷酸果糖激酶會(huì)被激活，糖無(wú)氧酵解增加，能夠補(bǔ)充生成ATP，但是通過(guò)這種方式產(chǎn)生的ATP要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于氧化磷酸化所生成的ATP，因此最終還是會(huì)造成能量代謝紊亂，給組織細(xì)胞帶來(lái)?yè)p害。本研究證明在缺血缺氧時(shí)，內(nèi)源性PCr不能滿足機(jī)體對(duì)ATP的需求。

在機(jī)體內(nèi)，PCr主要由肌酸經(jīng)肌酸激酶催化而來(lái)。 Balestrino M等[12]發(fā)現(xiàn)，肌酸能夠有效抑制去極化引起的大鼠腦組織的缺氧缺血損傷，由此可以推測(cè)，PCr可能對(duì)缺血缺氧的腦組織也具有保護(hù)作用。目前，已有一些醫(yī)護(hù)工作者將PCr試用于臨床的腦損傷患者，并取得了一些療效[13-14]。為了切實(shí)檢測(cè)PCr的腦保護(hù)作用，本研究復(fù)制了全腦缺血以及腦缺血再灌注小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⑦M(jìn)行了腦組織MDA含量的測(cè)定。MDA是自由基脂質(zhì)過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物，其含量高低可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化的水平，間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基損害的程度[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCr能夠顯著延長(zhǎng)全腦缺血小鼠的生存時(shí)間，并降低全腦缺血與腦缺血再灌注小鼠腦內(nèi)的MDA含量，證明PCr能夠通過(guò)提高腦內(nèi)ATP水平，增進(jìn)缺血缺氧腦內(nèi)的能量代謝進(jìn)而阻止自由基的產(chǎn)生，保護(hù)腦細(xì)胞。

本研究利用Na2S2O4構(gòu)建了缺氧缺糖PC12細(xì)胞損傷模型。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的細(xì)胞株，細(xì)胞膜上有NMDA受體、膽堿能M、N受體等，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，該細(xì)胞純化程度高、生長(zhǎng)繁殖快、培養(yǎng)周期短、使用方便、條件易控制并有可傳代性，所以可以代替神經(jīng)細(xì)胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究[16-19]。

LDH是無(wú)氧代謝的標(biāo)志性酶，廣泛存在于各組織的細(xì)胞漿內(nèi)，正常情況下不能通過(guò)細(xì)胞膜，而當(dāng)細(xì)胞受損或者死亡時(shí)，就能夠釋放到細(xì)胞外，細(xì)胞的受損程度與細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH活性成正比[20]。故測(cè)定培養(yǎng)液中LDH活性是反映細(xì)胞損傷的一種敏感且較為簡(jiǎn)便快捷的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖和存活狀態(tài)，LDH活性來(lái)反映細(xì)胞的損傷程度。結(jié)果表明：Na2S2O4引起的PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷后細(xì)胞活力降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量增加，證明細(xì)胞破損嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)PCr和肌酸均可顯著抑制PC12細(xì)胞缺氧缺糖的損傷情況,不同程度地提高受損PC12細(xì)胞的存活率并抑制LDH的釋放，并在一定范圍之內(nèi)具有劑量依賴性。當(dāng)藥物的濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，其抑制率達(dá)高峰，在此之后即使繼續(xù)增大藥物濃度，細(xì)胞的MTT值不再增加，培養(yǎng)液上清中的LDH含量也不再明顯下降，說(shuō)明此時(shí)藥物的保護(hù)作用已發(fā)揮到最大。因此，本實(shí)驗(yàn)中藥物的最佳濃度為10 mmol/L，與以往國(guó)外的文獻(xiàn)報(bào)道一致[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肌酸的作用效果和PCr相近。由于肌酸是PCr的代謝產(chǎn)物，所以推測(cè)PCr的抗氧自由基作用可能與其可以代謝成肌酸有關(guān)。

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