GRP94表達在大細胞肺癌NCI-H460細胞對順鉑耐藥中的作用

王 濤 ，王 琪，裴復(fù)陽

(1.大連大學(xué) 附屬中山醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116001； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 遼寧 大連 116027)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢。而且，80%的患者確診時已喪失手術(shù)機會。因此，化療在肺癌的治療中具有重要的作用。然而，化療耐藥一直是肺癌治療領(lǐng)域的熱點問題，腫瘤耐藥的發(fā)生與腫瘤細胞生存的微環(huán)境密切相關(guān)。由于腫瘤生長迅速，血液供應(yīng)相對不足，產(chǎn)生了低糖、缺氧及酸中毒的微環(huán)境，這些應(yīng)激條件可誘導(dǎo)一組被稱為糖調(diào)節(jié)蛋白的蛋白質(zhì)(Glucose Regulated Proteins,GRPs)的合成，GRPs中分子量為94 kDa的GRP94是重要的成員[1-2]。有研究表明GRP94在腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達，并與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性有關(guān)[3]。作者曾對肺鱗癌及腺癌中GRP94的表達與VP-16耐藥之間的相關(guān)性進行了研究[4-5]。但關(guān)于GRP94在大細胞肺癌中的表達情況及其表達是否與大細胞肺癌細胞對化療藥物順鉑的耐藥具有相關(guān)性，目前國內(nèi)外研究較少。本研究旨在通過檢測在誘導(dǎo)劑A23187及抑制劑BAPTA-AM作用下大細胞肺癌細胞NCI-H460中GRP94的表達水平及分析其表達與肺癌細胞對順鉑耐藥的相關(guān)性，探討GRP94在大細胞肺癌對順鉑耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

人肺癌NCI-H460標(biāo)準(zhǔn)細胞株(購于中科院細胞研究所)。試劑：RPMI-1640培養(yǎng)液、BAPTA-AM、A23187、順鉑、Trizol(Sigma產(chǎn)品)，RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL2000(Takara產(chǎn)品)，羊抗人GRP94抗體、羊抗人β-actin抗體、HRP-兔抗羊IgG(Santa Cruz公司)，MTT(Amresco公司)，DMSO (Sigma公司)。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：NCI-H460細胞株復(fù)蘇后培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、飽和濕度37 ℃的孵箱中培養(yǎng)。將5×104個細胞接種于25 mL的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，再將細胞分為A23187組，BAPTA-AM組與對照組，A23187組加入A23187(終濃度4 μmol/L)培養(yǎng)24 h；BAPTA-AM組加入BAPTA-AM(終濃度40 μmol/L)培養(yǎng)1 h；對照組加入PBS，培養(yǎng)24 h。

1.2.2 RNA 提取以及RT-PCR: 按試劑盒說明分別提取實驗組和對照組細胞的總RNA，制備cDNA，進行PCR 產(chǎn)物擴增。GRP94mRNA上游引物序列為5’CAGTTTTGGATCTTGCTGTGG 3’，下游引物序列為5’CAGCTGTAGATTCCTTTGC 3’；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5’AAGGATTCCTATGTGGGC 3’，下游引物序列為5’ CATCTCTTGCTCGAAGTC 3’。取PCR擴增產(chǎn)物10 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，EB染色，用美國UVP凝膠成像系統(tǒng)EC3System進行掃描分析，計算公式為：某樣品GRP94 mRNA的相對表達水平=樣品GRP94的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.3 蛋白提取及Western雜交：將細胞置于1.5 mL Eppendorf管中，加入RIPA緩沖液300 μL，以12000 r/min速度、4 ℃離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新管，再重復(fù)離心2次，-70 ℃保存；使用Bradford比色法測定蛋白含量，依次進行SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)印。取下轉(zhuǎn)印好的PVDF膜，放入封閉液中4 ℃封閉過夜，加入稀釋的羊抗人GRP94抗體(一抗，1∶400)及羊抗人β-actin(一抗，1∶400)， 37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次。再加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG(二抗，1∶5000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次，在室溫進行ECL顯色。用美國UVP公司EC3 System凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描分析，計算公式為：某樣品GRP94蛋白的相對表達水平=樣品GRP94的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.4 MTT比色法：取對數(shù)生長期的不同處理NCI-H460細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度的37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h。然后，加入不同濃度的順鉑(0、2、4、6、8、12 μmol/L)，每個濃度設(shè)1個主孔2個副孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，再向各孔加入MTT 20 μL，4 h后加DMSO溶解甲臢，在酶標(biāo)儀上選擇波長490 nm，檢測各孔A值，計算細胞生存率及IC50。細胞生存率=(實驗組A值-空白對照組A值)/(對照組A值-空白對照組A值)×100%；IC50：使用Bliss法計算；耐藥指數(shù)(resistance index, RI)=IC50實驗組/IC50對照組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均重復(fù)3次以上。實驗數(shù)據(jù)用MEAN±SD表示，采用 SPSS 12.0軟件處理，用單向方差分析比較多組間均數(shù)的差異，用Pearson相關(guān)分析GRP94mRNA表達與順鉑的IC50值的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GRP94核酸水平的表達

RT-PCR結(jié)果顯示：各組細胞 GRP94mRNA的相對表達量如圖1所示。A23187組、對照組、BAPTA-AM組GRP94mRNA的表達水平分別為：0.910±0.043、0.445±0.031、0.243±0.030，差異具有顯著性意義(P<0.05)。

2.2 GRP94蛋白水平的表達

Western-blot結(jié)果顯示：與核酸表達一樣，A23187組GRP94蛋白的表達最高，對照組次之，BAPTA-AM組最低(圖2)，分別為：0.843±0.024、0.256±0.023、0.123±0.021，差異具有顯著性意義(P<0.05)。

圖1 三組不同處理下NCI-H460細胞中GRP94在核酸水平的表達

圖2 三組不同處理下NCI-H460細胞中GRP94在蛋白水平的表達

2.3 細胞生存率與GRP94表達的相關(guān)性

各組細胞對順鉑的生存率如圖3。A23187組、對照組、BAPTA-AM組對順鉑的IC50值分別為：3.34±0.12、4.82±0.29、8.12±0.21。A23187組細胞生存率明顯低于對照組，BAPTA-AM組細胞生存率明顯高于對照組, 差異具有顯著性意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)提示：NCI-H460各組細胞GRP94 mRNA及蛋白表達與相應(yīng)順鉑的IC50值之間呈負相關(guān)(r分別為-0.91和-0.84，P<0.05)。

圖3 各組細胞對順鉑的生存曲線

3 討 論

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP94是熱休克蛋白90家族中的一類應(yīng)激蛋白，具有促進錯誤折疊蛋白恢復(fù)正常構(gòu)象、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)Ca2+平衡并調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+依賴性蛋白修飾反應(yīng)、對抗氧化應(yīng)激，從而保護細胞的作用[6]。各種應(yīng)激條件如葡萄糖缺乏、蛋白錯誤折疊、蛋白糖基化及一些誘導(dǎo)劑(如Ca2+-ATPase抑制劑thapsigargin)都可以激活GRP94轉(zhuǎn)錄基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生GRP94蛋白[7-8]。在卵巢癌、肺癌、胰腺癌等腫瘤的研究中，GRP94的過表達與腫瘤組織的分化程度及腫瘤進展的階段以及腫瘤的耐藥密切相關(guān)[4-5,9-11]。

A23187是一種Ca2+轉(zhuǎn)運載體，作用于細胞后，可使細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度([Ca2+]ER)下降，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]c)增加。因而，可以造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+失衡，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活GRP基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生GRP蛋白[12]。作者早期報道了A23187可以有效誘導(dǎo)人大細胞肺癌細胞NCI-H460 GRP78的表達。本研究同樣表明，A23187也可以明顯誘導(dǎo)大細胞肺癌細胞NCI-H460 GRP94在蛋白及核酸水平的表達。

脫氧雪腐鐮刀菌、烯醇(vomitoxin)、VST、BAPTA-AM等均能抑制GRPs表達。而目前關(guān)于BAPTA的研究較多。Chang等[13]研究發(fā)現(xiàn)BAPTA-AM能夠抑制GRP78的表達，并能夠減弱或消除GRP78高表達對細胞的保護作用。Takano[14]研究發(fā)現(xiàn)，在原始T細胞中抗CD3抗體等可以誘導(dǎo)GRP78的表達，而BAPTA-AM則抑制其表達。之前，關(guān)于BAPTA可以抑制GRPs表達的研究主要集中在GRP78上，本研究證明了BAPTA-AM也可以抑制大細胞肺癌細胞NCI-H460 GRP94在蛋白及核酸水平的表達。

順鉑屬細胞周期非特異性藥物，抗癌譜廣，自70年代用于臨床以來，已成為治療肺癌、食管癌、惡性淋巴瘤、卵巢癌等多種惡性腫瘤的一線化療藥物。Mese等[15]通過對人表皮細胞癌A431細胞的研究發(fā)現(xiàn)，GRP78表達增高能夠提高野生株A431細胞對順鉑的敏感性，而對耐藥株A431/CDDP2細胞沒有影響。Belfi等[16]利用實驗證明人結(jié)腸癌細胞HCT116、SW480與VACO-8中GRP78的表達增高，可以增強結(jié)腸癌細胞對順鉑的敏感性。目前，關(guān)于GRP可以增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性的研究主要集中在GRP78上，但對于GRP94是否在肺癌中有同樣的表現(xiàn)目前尚未報道。本實驗的結(jié)果顯示， A23187濃度為4 μmol/L時，NCI-H460細胞中GRP94的表達明顯升高，相應(yīng)的細胞在順鉑作用下的生存率卻明顯降低，BAPTA-AM濃度40 μmol/L時，NCI-H460細胞中GRP94的表達明顯降低，相應(yīng)的細胞在順鉑作用下的生存率卻明顯升高；表明GRP94高表達與NCI-H460細胞對順鉑耐藥呈現(xiàn)負相關(guān)，其高表達能夠提高大細胞肺癌對順鉑的敏感性。采用A23187等上調(diào)GRP94的表達，可望成為提高肺癌化療效果的新手段。

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