丁香胃靈合劑對慢性萎縮性大鼠胃炎SS、Gas、Bax的影響

婁 華，朱耀環(huán)，李會朋，李素潔

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 2008級研究生，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，遼寧 大連 116027；3.大連民族學(xué)院 校醫(yī)室，遼寧 大連 116620)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病，以局限性或廣泛性胃黏膜固有腺體的萎縮改變，黏膜層變薄為主要特征。其發(fā)病率、癌變率較高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏理想的治療方法，而中醫(yī)藥對該病進行辨證論治，在治療上發(fā)揮了其獨特的優(yōu)勢。丁香胃靈合劑(CWLM)在臨床治療CAG取得了良好的效果，但其作用機理仍不明確。本研究旨在觀察CWLM對CAG模型大鼠生長抑素(somatostatin，SS)、胃泌素(gastrin，Gas)含量及胃黏膜Bax表達的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動 物

健康清潔級 Wistar 大鼠60只，雌雄各半，體重180～230 g，大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 實驗藥物

丁香胃靈合劑組成：丁香、桂枝、砂仁、白芍、白術(shù)、川芎、丹參、石斛、黃芪、甘草等組成，由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供。

1.3 試劑及儀器

試劑：氨水含NH325%～28%(沈陽新興試劑廠)；水楊酸鈉(天津市化學(xué)一廠)；兔抗鼠Bax多抗(北京博奧森生物技術(shù)公司)；SS與Gas ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)公司)；SP試劑盒(美國ZYMED公司)；DAB染色液(美國ZYMED公司)。

儀器：高速離心機HHR21型，北京醫(yī)用離心機廠；電熱恒溫水浴箱HWS-20型，江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；酶標(biāo)儀Thermo 354型，美國；光學(xué)顯微鏡Olympus BX-51型，日本。

1.4 方 法

1.4.1 分組：將60只健康Wistar大鼠隨機分為5組，即正常組、CAG組、CWLM低劑量組、CWLM中劑量組、CWLM高劑量組，每組12 只。除正常組外各組大鼠采用濃度為2%水楊酸鈉溶液按1 mL/100 g灌胃2個月，1次/d，灌胃前后1 h禁食禁水，并自由飲用0.05%的氨水，2 d足量喂食，1 d停食；正常組給予1 mL/100 g體重生理鹽水日1次灌胃，自由飲水進食，直至實驗結(jié)束。造模過程中CAG組死亡1只，CWLM低劑量組、CWLM中劑量組各死亡1只，正常組沒有死亡。隨機抽取2只大鼠做胃黏膜病理組織學(xué)檢查，確認造模成功后進行藥物干預(yù)實驗，CWLM低劑量2 g生藥/ (kg·d )灌胃，相當(dāng)于人的臨床用量，1次/d；CWLM中劑量組4 g生藥/ (kg·d)灌胃，相當(dāng)于人臨床用量的2倍，1次/d；CWLM高劑量組8 g生藥/ (kg·d )灌胃，相當(dāng)于人臨床用量的4倍，1次/d；CAG組予1 mL /100 g體重生理鹽水1次/d灌胃。各組灌胃均50 d后，處死所有大鼠。

1.4.2 標(biāo)本中Gas、SS含量的測定：采用摘取眼球法取血，約5 mL/只，離心10 min，留取血清，采用ELISA法按試劑說明書檢測Gas、SS含量。

1.4.3 大鼠組織細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達的檢測：操作包括兩部分：①剖胃取材后,用10%福爾馬林固定，按照常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片；取切片拷至已用多聚賴氨酸防脫片處理的載玻片上，進行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色(按SABC試劑盒說明書的步驟操作，每次實驗以PBS代替一抗作陰性對照)。②在光鏡下進行觀察，每張切片至少觀察5個視野，以細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)均勻一致的棕褐色顆粒為陽性細胞。陰性表達：未見棕黃色染色的細胞；運用計算機圖像分析儀定量分析大鼠胃黏膜Bax蛋白表達的灰度值，在400倍光鏡下，測定陽性細胞灰度?；叶戎凳欠从惩腹饷芏鹊亩恐笜?biāo)，其值越高，相應(yīng)的蛋白表達量越少；反之則表示蛋白表達越多。計算出平均灰度值，即陽性部位灰度值與檢測面積之比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 血清Gas與SS含量的變化

與正常組比較,CAG組血清Gas和SS含量分別降低和升高，差異均有顯著性意義(P<0.01)；與CAG組比較，CWLM各治療組Gas和SS含量分別有所升高和降低，其中低劑量組Gas雖升高,但差異無顯著性意義(P>0.05),且仍顯著低于正常組；中劑量組Gas升高，差異有顯著性意義(P<0.05);而高劑量組Gas顯著升高(P<0.01),并接近正常組(P>0.05);各治療組間相比，差異無顯著性意義(P>0.05)。與CAG組比較，CWLM各治療組SS含量不同程度的降低, 差異有顯著性意義(P<0.05或P<0.01),而低劑量組仍顯著高于正常組(P<0.01),各治療組間比較, 高劑量組明顯高于低劑量組，差異有顯著性意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清Gas和SS含量的變化

2.2 胃黏膜Bax表達的變化

大鼠胃黏膜中Bax的平均灰度值在CAG組、CWLM低、中、高各劑量組及正常組各組中的表達呈遞減趨勢，即相應(yīng)Bax的表達呈遞增趨勢。與CAG組比較，CWLM低、中、高劑量組Bax的平均灰度值明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.05或P<0.01)，低劑量組與正常組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。各治療組間相比，差異無顯著性意義(P>0.05)，見圖1～5及表2。

圖1 CAG組Bax表達(×400)

圖2 正常組Bax表達(×400)

圖3 CWLM低劑量組 Bax表達(×400)

圖4 CWLM中劑量組Bax表達(×400)

圖5 CWLM高劑量組Bax表達(×400)

表2 各組大鼠胃粘膜Bax表達的變化

3 討 論

CAG由多種因素如飲食不節(jié)、情志失調(diào)等導(dǎo)致脾胃虛弱，久則氣滯血瘀，氣血不能榮養(yǎng)胃絡(luò)，胃膜失養(yǎng)，逐漸萎縮，最終形成CAG繁雜的病理改變。本課題組以益氣健脾和胃，活血化瘀之法組方丁香胃靈合劑治療本病，方中以丁香為主藥，取其溫中降逆、散寒止痛之效，黃芪補脾胃之氣，扶正固本，使脾氣健運，氣血化生有源，白術(shù)扶植脾胃，散寒除弊，消食除痞，白芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，使肝氣不犯脾胃。丹參、川芎聯(lián)用增強活血行氣化瘀之效，石斛養(yǎng)胃生津，使胃陰得充，諸藥合用可使補中有消，補而不滯，共奏健脾益氣、活血化瘀、和胃理氣、陰陽和合之效。前期研究已證實CWLM可能通過改善胃黏膜微循環(huán)、調(diào)節(jié)胃腸蠕動和分泌功能、增強免疫力等綜合作用來發(fā)揮對CAG的治療作用[1]。

有研究表明CAG癌前病變中存在著胃黏膜營養(yǎng)因子(如Gas)、胃腸激素(如SS等)分泌失調(diào)[2]、細胞凋亡異常(如Bax減少等)等因子的異常表達。Gas是由胃及十二指腸G細胞合成、分泌的胃腸道多肽激素,其既能刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌,又能通過增加其DNA、RNA及蛋白的合成來刺激胃黏膜細胞的生長,增加胃黏膜血流量，從而發(fā)揮營養(yǎng)胃黏膜的功能。CAG患者隨著胃竇萎縮的不斷加重，G細胞數(shù)量不斷減少，Gas的含量隨之下降[3]。胃腸激素中的SS作為人體內(nèi)重要的炎癥負性調(diào)節(jié)肽之一[4]，主要通過旁分泌、自分泌等不同途徑發(fā)揮作用。正常情況下，SS不但能抑制胃酸和胃蛋白酶分泌,而且能與Gas組成Gas-SS-胃酸分泌軸，維持胃腸的正常生理功能[5]。CAG大鼠胃黏膜中SS的含量顯著高于正常組織[6]，SS的異常表達可導(dǎo)致組織細胞生長調(diào)節(jié)失控,最終形成腫瘤[7]。本實驗結(jié)果顯示：CAG大鼠血清Gas含量下降，而血清SS含量明顯升高。經(jīng)丁香胃靈合劑干預(yù)后,Gas含量升高、SS含量下降，CWLM 3種不同劑量呈不同程度的升高血清Gas含量，降低血清SS含量。結(jié)合相關(guān)文獻報道[8]，CWLM可通過升高CAG大鼠血清Gas含量，降低血清SS含量，使Gas-SS-胃酸分泌軸正常發(fā)揮，促進Gas、胃酸、胃蛋白酶等分泌，糾正低酸狀態(tài),發(fā)揮其保護胃黏膜、促進腺體的再生、增加胃黏膜血流的作用。且其作用的發(fā)揮有明顯劑量依賴性，本實驗中高劑量組較其它治療組升高血清Gas含量，降低血清SS含量，發(fā)揮治療作用方面CWLM效果最佳。

Bax是Bcl-2基因家族中極重要的細胞促凋亡基因，Bax在高表達時與Bcl-2形成異源二聚體,促進細胞凋亡,低表達時可使CytC從線粒體中釋放，繼而激活caspase，以同源二聚體的形式存在，抵消Bcl-2基因的抑制凋亡作用而對細胞凋亡有正向調(diào)節(jié)作用[9，10]。正常生理狀態(tài)下，胃黏膜上皮細胞死亡的主要形式是細胞凋亡，黏膜憑借Bax促凋亡與Bcl-2促增殖之間的平衡維持其穩(wěn)定性[11]。一旦該平衡被打破，則有可能發(fā)生病變。目前已有不少文獻報道從正常胃黏膜→萎縮性胃炎→腸化生→異型增生→胃癌，Bax表達逐漸減弱，同時細胞凋亡指數(shù)逐漸降低，使胃黏膜細胞受損，細胞凋亡減少，那些變異的細胞可能因為凋亡機制得不到正常啟動在體內(nèi)聚集，最終導(dǎo)致腫瘤形成[12]。本實驗結(jié)果顯示：由正常組→CWLM高劑量組→CWLM中劑量組→CWLM低劑量組→模型組，胃黏膜Bax陽性表達呈明顯遞減趨勢；與CAG組比較，CWLM 3種不同劑量均能不同程度的上調(diào)Bax表達水平，使Bax與Bcl-2形成異源二聚體，或自身形成同源二聚體，積極促進細胞凋亡，從而在一定程度上促使細胞數(shù)目增減平衡，發(fā)揮控制甚至逆轉(zhuǎn)CAG病理黏膜改變的作用。且CWLM在抑制CAG大鼠胃黏膜細胞的異常增殖方面呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，其中高劑量組效果最明顯。

CWLM可通過升高血清Gas含量、降低血清SS含量，上調(diào)Bax表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞凋亡、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能、修復(fù)胃黏膜損傷等作用來實現(xiàn)對CAG大鼠胃黏膜病理改變的修復(fù)，達到治療CAG的目的。且CWLM在治療CAG方面具有明顯的劑量相關(guān)性，一定程度上提高藥物劑量可以達到更好的治療效果。

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