FHIT,Caspase-3及Survivin蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其意義

常方芝，田字彬

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化科，山東 青島 266000)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展涉及多種癌基因的激活和多種抑癌基因的失活；與細(xì)胞凋亡的抑制，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的各種因子的平衡調(diào)控異常密切相關(guān)[1]。目前研究顯示，結(jié)腸癌是在抑癌及促癌等多種基因作用下的一種遺傳性疾病，常表現(xiàn)為結(jié)腸癌組織中的促癌基因表達(dá)上調(diào)或抑癌基因表達(dá)的缺失[2]，其中FHIT(fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)基因，Caspase-3及Survivin基因是參與細(xì)胞增殖及凋亡的相關(guān)基因或蛋白，與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但在結(jié)腸癌發(fā)生過程中相互調(diào)控的關(guān)系尚未明確，本文對(duì)FHIT，Caspase-3及Survivin蛋白在結(jié)腸癌組織表達(dá)情況及其相關(guān)性進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

收集青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)病理科2006年～2007年經(jīng)手術(shù)治療的患者結(jié)腸癌組織及癌旁組織60例?；颊吣行?6例，女34例，年齡37～79歲，平均(56±18.4)歲，標(biāo)本均經(jīng)病理診斷明確，具備完整病歷資料，所有患者術(shù)前無放化療治療史，無免疫抑制藥物治療史，未合并其它器官或系統(tǒng)的惡性腫瘤。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人多克隆FHIT、Survivin、Caspase-3抗體、非免疫山羊血清購于武漢博士德生物試劑有限公司；S-P通用試劑盒、DAB超敏顯色試劑盒購于北京賽遲生物有限公司；其它試劑由青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 染色方法

結(jié)腸癌組織及癌旁組織標(biāo)本采用SP免疫組化染色三步法，石蠟包埋的病理組織切片冰盒冰凍3 min后，采用切片機(jī)2 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)展片、烘干，采用pH7.0的PBS緩沖液浸泡沖洗，微波修復(fù)暴露抗原，過氧化酶阻斷溶液，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，采用無抗原性的非免疫山羊血清去除雜質(zhì)干擾，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育，PBS沖洗，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液終止反應(yīng)，終止反應(yīng)后采用DAB顯色，采用蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)，常規(guī)脫水干燥、透明、中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷

切片觀察采用400倍光鏡放大，陽性細(xì)胞分析采用網(wǎng)格計(jì)數(shù)法，每張切片選擇5個(gè)不重復(fù)的視野，依據(jù)觀察到的細(xì)胞數(shù)目及染色細(xì)胞數(shù)目計(jì)算陽性結(jié)果，淡藍(lán)色背景下細(xì)胞不著色判定為陰性結(jié)果，淡藍(lán)色背景下細(xì)胞內(nèi)棕黃色染色判定為陽性細(xì)胞，視野內(nèi)陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)比例<1/3為弱陽性，1/3～1/2為中等陽性，>1/2判定為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用同斯皮爾曼相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 FHIT,Caspase-3及Survivin蛋白在結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織的表達(dá)

FHIT蛋白主要表達(dá)在癌旁結(jié)腸黏膜和結(jié)腸癌組織細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)者可見淡藍(lán)色背景下顆粒樣棕黃色顆粒，表達(dá)強(qiáng)度以中等陽性及弱陽性為主，癌旁組織表達(dá)陽性率高于結(jié)腸癌組織(圖1、表1)；Caspase-3蛋白主要表達(dá)在癌旁結(jié)腸黏膜和結(jié)腸癌組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核胞漿中，表達(dá)陽性者可見淺藍(lán)色背景下棕黃色顆粒樣染色，表達(dá)強(qiáng)度以中等陽性為主,癌旁組織表達(dá)陽性率高于結(jié)腸癌組織(圖2、表1)；Survivin蛋白主要表達(dá)在癌旁結(jié)腸黏膜和結(jié)腸癌組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核胞漿中，陽性表達(dá)者淺藍(lán)色背景下可見棕黃色顆粒樣或團(tuán)塊樣染色，癌旁組織表達(dá)陽性率低于結(jié)腸癌組織(圖3、表1)。

2.2 FHIT與Caspase-3蛋白在結(jié)腸癌組織表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)腸癌組織60例中，F(xiàn)HIT與Caspase-3蛋白同時(shí)陽性表達(dá)者14例(23.3%)，同時(shí)陰性表達(dá)者39例(65.0%)，相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中FHIT與Caspase-3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.410，P=0.006)。

2.3 FHIT與Survivin蛋白在結(jié)腸癌組織表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)腸癌組織60例中，F(xiàn)HIT與Survivin蛋白同時(shí)陽性表達(dá)者12例(20.0%)，同時(shí)陰性表達(dá)者4例(6.7%)，相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織FHIT與Survivin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.454，P=0.004)。

3 討 論

近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[3]，結(jié)腸癌的發(fā)生同機(jī)體的抑癌因素及促癌因素失衡密切相關(guān)。研究顯示，在結(jié)腸癌組織，具有抑癌作用的細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)常表達(dá)缺失，而具有促癌作用的相關(guān)細(xì)胞因子出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，其共同調(diào)控結(jié)腸組織的異常增生、癌變[4]。

FHIT基因是三聯(lián)體組氨酸家族成員，F(xiàn)HIT蛋白是FHIT基因基因編碼的生物活性蛋白，F(xiàn)HIT蛋白具有多種生物活性，并且參與體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。在FHIT蛋白表達(dá)水平降低時(shí)，其能通過上調(diào)ATP類似物ApaA的表達(dá)減少水解發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，抑制細(xì)胞的凋亡。同時(shí)FHIT蛋白水平下降能夠影響細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性，使mRNA容易發(fā)生突變及分解，其可能是導(dǎo)致結(jié)腸組織癌變的機(jī)制之一[5,6]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常的大腸黏膜上皮相比，F(xiàn)HIT蛋白在大腸癌組織中不表達(dá)或僅少量表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)告相似，說明它在大腸癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，也有研究報(bào)道FHIT蛋白的表達(dá)缺失或減少與大腸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后呈正相關(guān)[7],說明對(duì)結(jié)腸癌組織的FHIT蛋白的檢測(cè)對(duì)預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值。近年來的研究顯示，F(xiàn)HIT基因位點(diǎn)能夠作為結(jié)腸癌基因治療的靶點(diǎn)[8]，對(duì)結(jié)腸癌組織FHIT蛋白的檢測(cè)能夠?yàn)閭€(gè)體的結(jié)腸癌基因治療的可能性提供參考依據(jù)。

圖1 FHIT蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)(×400)

圖2 Caspase-3在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)(×400)

圖3 Survivin蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)(×400)

表1 FHIT，Caspase-3及Survivin蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

Caspase-3蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族成員，又稱細(xì)胞凋亡因子,在細(xì)胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵性作用。其能夠通過對(duì)細(xì)胞凋亡的特異蛋白質(zhì)剪切誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)能夠通過細(xì)胞外途徑接受細(xì)胞外環(huán)境中TNF、Fas等細(xì)胞凋亡信號(hào)的激活，引起細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]，同時(shí)又能通過細(xì)胞內(nèi)途徑接受線粒體細(xì)胞色素C的誘導(dǎo)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)[10]，誘導(dǎo)正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的凋亡，是機(jī)體控制細(xì)胞異常增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一。研究顯示，Caspase-3蛋白的低表達(dá)，細(xì)胞凋亡機(jī)制失控是結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制之一。在對(duì)結(jié)腸癌組織Caspase-3蛋白表達(dá)與生物學(xué)特性的研究中發(fā)現(xiàn)[11]，Caspase-3蛋白的表達(dá)缺失同結(jié)腸癌的分化程度有關(guān)，提示Caspase-3表達(dá)缺失同結(jié)腸癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物奧沙利鉑能夠通過激活Caspase-3蛋白的表達(dá)發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制[12]，提示對(duì)Caspase-3蛋白編碼基因位點(diǎn)的干預(yù)可能成為腫瘤基因治療的新途徑。

Survivin蛋白又稱為細(xì)胞增殖因子，是凋亡蛋白抑制因子家族的成員之一，能通過與前凋亡蛋白Smac/DIABLO結(jié)合，拮抗其促凋亡活性[13]，其能通過與細(xì)胞周期中的多個(gè)酶系作用，作用于細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，還與血管生成有關(guān)，它幾乎在人類腫瘤中都有不同水平的表達(dá)。Survivin的過度表達(dá)是組織細(xì)胞異常增生的機(jī)制之一，Survivin蛋白在正常及惡變的組織表達(dá)存在較大的差異，在結(jié)腸癌組織，Survivin蛋白表達(dá)特異性地升高，而在癌旁正常的黏膜組織表達(dá)率極低或不表達(dá)[14]，提示Survivin蛋白與大腸癌的發(fā)生、增殖密切相關(guān)。有研究顯示，結(jié)腸癌組織中Survivin蛋白的表達(dá)水平同結(jié)腸癌的生物學(xué)行為有關(guān)，在Survivin蛋白高表達(dá)的結(jié)腸癌組織，往往預(yù)示著其高度的惡性生物學(xué)行為[15]。Yamamoto T等[16]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用天然的反義Survivin(EPR1)作用于人類結(jié)腸癌細(xì)胞株，不僅可下調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞的增殖，而且增強(qiáng)凋亡作用，增加對(duì)抗癌藥物的敏感性。Rodel F等[17]通過研究Survivin基因在三種不同放射敏感性的直腸癌細(xì)胞株(SW480、HCT-15、SW48)以及54例直腸癌患者的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Survivin基因的表達(dá)與放射誘導(dǎo)的凋亡之間存在負(fù)相關(guān)，證明Survivin在直腸癌中是一個(gè)重要的凋亡抑制基因，這種差異表達(dá)使它有可能成為腫瘤診斷和預(yù)后的新標(biāo)記及治療的新靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)在抑制細(xì)胞凋亡的過程中，Survivin基因通過阻斷線粒體細(xì)胞色素C釋放，直接抑制下游凋亡效應(yīng)因子Caspase-3和Caspase-7起作用[18]，經(jīng)過與紡錘體纖維的結(jié)合，間接抑制caspase對(duì)紡錘體的水解作用，有利于保護(hù)有絲分裂細(xì)胞的完整性，抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)具有抑癌作用的FHIT及Caspase-3蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織，F(xiàn)HIT及Caspase-3蛋白表達(dá)陽性率降低，在大部分結(jié)腸癌組織FHIT和Caspase-3蛋白的表達(dá)缺失，而對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用的Survivin在結(jié)腸癌組織存在過度表達(dá)現(xiàn)象，提示FHIT,Caspase-3及Survivin蛋白的表達(dá)缺失或上調(diào)參與結(jié)腸組織的癌變。同時(shí)相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)HIT同Caspase-3和Survivin表達(dá)之間存在相關(guān)關(guān)系，說明在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中，F(xiàn)HIT、Caspase-3蛋白低表達(dá)或表達(dá)缺失引起的細(xì)胞凋亡抑制及Survivin蛋白上調(diào)引起的細(xì)胞增殖活性升高共同發(fā)生影響，而非單一因素引起的細(xì)胞異常增殖或細(xì)胞永生化。有研究顯示Survivin能夠通過抑制Caspase-3表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用，在既往的研究結(jié)果中也證實(shí)，在惡性腫瘤組織中其與Caspase-3表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。FHIT基因能夠通過激活Caspases-8及Caspases-9引起Caspases酶介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。說明FHIT,Caspase-3及Survivin蛋白之間在結(jié)腸癌發(fā)生的過程中可能存在相互調(diào)控的關(guān)系，共同介導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生過程，而對(duì)于結(jié)腸癌的基因靶向或生物學(xué)治療，也需要在多個(gè)基因位點(diǎn)或多個(gè)水平層次上進(jìn)行。在結(jié)腸癌的臨床治療過程中，F(xiàn)HIT,Caspase-3及Survivin蛋白的聯(lián)合檢測(cè)，可能為其干預(yù)措施提供依據(jù)。

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