HPLC柱切換法比較輕度燒傷感染與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度

段曉霞 鄭小林 張春玉

燒傷感染為常見的燒傷并發(fā)癥。國外學(xué)者研究表明燒傷感染患者由于其血漿蛋白水平的下降等生理原因，使其對藥物的處置程度也相應(yīng)發(fā)生變化，具體表現(xiàn)在藥物的腎小球濾過率增加［1］、藥物的代謝增加等，從而導(dǎo)致藥物的血藥濃度下降。為保證抗感染的效果，國外學(xué)者提出增加抗菌藥物的劑量或者縮短其給藥間隔期。頭孢吡肟為新一代的頭孢菌素類抗菌素，抗菌活性高，對β-內(nèi)酰胺酶尤其是染色體介導(dǎo)的Richmond-sykesⅠ型β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌有很強的抗菌活性。本藥對產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、沙雷菌屬的抗菌活性超過頭孢他定等第三代頭孢菌素;對銅綠假單胞菌的抗菌作用與頭孢他定相似或略差;對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌的抗菌活性也比第三代頭孢菌素有所增強［2］。由于燒傷患者的體液平衡變化程度與燒傷的輕重程度有關(guān)，故為合理化應(yīng)用抗菌藥物，研究不同燒傷程度的抗菌藥物濃度很有必要。有關(guān)輕度燒傷感染與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度的比較，國內(nèi)未見報道，為優(yōu)化燒傷感染患者的抗菌藥物給藥方案，本文采用HPLC柱切換法比較了輕度與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度。

1 設(shè)備與試劑

1.1 設(shè)備 Waters高效液相色譜儀(美國密理博公司)、Waters2010系統(tǒng)工作站(美國密理博公司)、Waters 996光電二極管陣列檢測器(美國密理博公司)、Waters510雙泵(美國密理博公司)、700柱切換閥(美國Rheodyne);HL-1型恒流泵(上海醫(yī)療器械廠);Rios超純水器(美國Millipore公司);分析柱Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm);預(yù)柱(50 mm ×5 mm)，內(nèi)裝 μBondapak C18填料37～50μm，濕法裝柱;高速離心機:上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2 試劑 頭孢吡肟(對照品，廣州Sigma公司)、頭孢曲松(分析純，廣州Sigma公司)、乙腈(色譜純，天津四友試劑公司)、枸櫞酸鈉(分析純，廣州 Sigma公司)、二氯甲烷(分析純，廣州Sigma公司)、三氟乙酸(分析純，廣州Sigma公司)、雙蒸水(自制，電阻率18 mΩ)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集 樣品來源于15例輕度燒傷感染和11例中度燒傷感染男性患者，患者年齡(31±5)歲、體重(61±9)kg、體溫(38.6±0.5)℃，血清肌酐max＜104μmol/min。血清樣品均于靜脈滴注完患者2 g頭孢吡肟后的1，2，4，8和12 h采集并放置于-30℃的冰箱保存。

2.2 樣品處理 在2 ml的在血清樣品中加入1 mg/min-1頭孢曲松內(nèi)標(biāo)液50μl旋渦振蕩3 min后加入1 ml乙腈，再經(jīng)旋渦振蕩3 min后，以12000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液加2 ml二氯甲烷后立即旋渦蕩5 min，再高速離心(12000轉(zhuǎn)/min)5 min，取上層水層進樣25μl。

2.3 色譜條件 分析流動相:乙腈-水(4.5∶9.5V/V)，加適量枸櫞酸鈉調(diào)pH至5.5;流速:1.0 ml/min;檢測波長:305 nm，靈敏度0.01AUFs，柱溫(30±0.1)℃;預(yù)處理流動相:pH值2.6的磷酸溶液，流速:2.0 ml/min。

在該色譜條件下，樣品、內(nèi)標(biāo)分離良好，色譜圖譜如圖2、圖3。

2.4 柱切換分離測量流程

2.4.1 生物樣本預(yù)處理 柱切換系統(tǒng)分離預(yù)處理流程裝置見圖1中虛線。生物樣本注入預(yù)柱后，在預(yù)柱中進行純化和富集，再經(jīng)預(yù)處理流動相沖洗預(yù)柱。

圖1 柱切換系統(tǒng)分離測量流程裝置圖

2.4.2 生物樣本測量 柱切換系統(tǒng)分離預(yù)處理流程裝置見圖1中實線。待血漿中大部分雜質(zhì)沖洗后，高壓閥切換，使預(yù)柱和分析柱連接為串聯(lián)狀態(tài)，分析流動相進入預(yù)柱將保留在預(yù)柱中的氟尿苷沖洗入分析柱進行分離測量。然后切換閥經(jīng)再次切回使分析柱和預(yù)柱的連接中斷，用預(yù)處理流動相充分平衡預(yù)柱后，即可進行下次進樣。柱切換操作時間表見表1，血漿測量色譜見圖2，3。

圖2 空白血漿色譜圖

圖3 頭孢吡肟血漿色譜圖(A:頭孢吡肟，B:內(nèi)標(biāo))

表1 柱切換操作時間表

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 將25 mg頭孢吡肟對照品溶于雙蒸水配制成2 mg/ml的原液，然后于容量瓶中稀釋為2000，1000，500，200，100，50，20，2.5 和 1 μg/ml的儲備液。隨后，將空白血漿加至上述儲備液中，配制為 200，100，50，20，10，5，2，1，0.5μg/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。將25 mg頭孢曲松對照品溶于雙蒸水配制成1 mg/ml內(nèi)標(biāo)溶液。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系 分別取標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品2 ml，按2.2項下處理，進樣25μl，經(jīng)采集數(shù)據(jù)、建立頭孢吡肟光譜庫、優(yōu)化積分參數(shù)，按頭孢吡肟的濃度為橫坐標(biāo)、頭孢吡肟與頭孢曲松的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在血漿中頭孢吡肟在0.5～200μg/ml的線性范圍內(nèi)得到線性關(guān)系良好的曲線方程:y=0.0347X+0.0059(r=0.9995)。

2.7 精密度試驗及相對回收率試驗 用空血漿配制頭孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三個濃度的血樣，按“2.2”項下處理，進樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，按內(nèi)標(biāo)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法自動求得樣品含量，計算相對回收率，結(jié)果頭孢吡肟濃度為0.5μg/ml的平均回收率(92.91±6.71)%，RSD:7.22%;10μg/ml的平均回收率(95.13±4.85)%，RSD=5.09%;200μg/ml的平均回收率(94.83±4.56)%，RSD=4.81%。

3 結(jié)果

3.1 日間差、日內(nèi)差 用空血漿配制頭孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三個濃度的血樣，按“2.2”項下處理，進樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，計算頭孢吡肟與頭孢曲松的峰面積比。日內(nèi)差(間隔1 h，n=5)與日間差(間隔24 h，n=6)，結(jié)果見表2。

表2 日間差、日內(nèi)差

由表2可知日內(nèi)差、日間差的相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于10%，表明實驗方法相對穩(wěn)定。

3.2 輕度燒傷組和中度燒傷組的頭孢吡肟的血藥濃度 將輕度燒傷感染組和中度燒傷感染組的血漿樣品按2.2項下處理，進樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，按內(nèi)標(biāo)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法自動求得樣品含量，頭孢吡肟的血藥濃度見表3。

表3 輕度燒傷組和中度燒傷組頭孢吡肟的血藥濃度

頭孢吡肟在輕度燒傷組和中度燒傷組的血藥濃度按成組比較，經(jīng)SPSS8.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示:中度燒傷患者頭孢吡肟的代謝或消除大于輕度燒傷感染，故應(yīng)適當(dāng)縮短中度燒傷感染患者的頭孢吡肟的滴注的間隔時間或增大其用藥劑量。

4 討論

4.1 從表2結(jié)果可知，中度燒傷組的頭孢吡肟血藥濃度顯著低于輕度燒傷組(P＜0.05)，這可能與中度燒傷患者的藥物蛋白結(jié)合率有關(guān)［3］。

4.2 本文提示縮短中度燒傷感染患者的頭孢吡肟的滴注的間隔時間或增大其用藥劑量結(jié)論，主要是因為中度燒傷的藥血濃度因燒傷的因素增加了藥物的代謝，故需了通過調(diào)整用藥劑量或增加用藥頻次的給藥方案提高該類患者的血藥濃度。

4.3 本實驗在測量樣品時采用了簡易的離心生物樣品處理法，該步驟有賴于柱切換液相色譜法的特點，回避了單純HPLC法因蛋白質(zhì)與流動相中的有機溶劑發(fā)生反應(yīng)、導(dǎo)致沉淀，堵塞色譜柱，故不能直接進樣的缺點［4］。

4.4 HPLC柱切換法的原理是:樣品中的蛋白質(zhì)及其他內(nèi)源雜質(zhì)受親水性外表面的作用和孔徑大小的限制，被預(yù)處理流動相直接洗脫出來，而樣品中的被測物在洗脫至分析柱之前被吸附在填料間隙中，得以凈化和富集，然后切換至并分析柱相連接，用分析流動相將被測物從預(yù)柱洗脫出至分析柱，進行分離測量。從而提高了分離和檢測效率。

［1］ Loirat P J，Rohan A.Baillet F，et al.Increased glomerular filtration rate in patients with major burns and itseffect on the pharmacokinetics of tobramycin N Engl JMed，1978，299:915-919．

［2］ Sanders，CC．Cefepime:the next generation?Clin Infect Dis，1993，17:369-379．

［3］ Martyn，J A J，D R Abernethy，D J Greenblatt．Plasma protein binding of drugs after severe burn injury.Clin.Pharmacol.Ther，1984，35:535-539．

［4］ 顧云.柱切換HPLC技術(shù)在生物樣品測定中的應(yīng)用.天津藥學(xué)，2003，15(2):80-82．