依達(dá)拉奉對大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)元凋亡的影響

周亞東 楊 琳 李修斌 湯慶賓 夏作理 史繼學(xué)

依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，其分子結(jié)構(gòu)上具有親脂基團(tuán)，易到達(dá)腦組織，血腦屏障的通透性高達(dá)60%，具有自由基清除和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，可以抑制腦細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞)的過氧化損傷，減輕腦缺血引起的腦水腫和組織損害，是一種有效的腦神經(jīng)保護(hù)劑。自問世以來，已被廣泛用于腦梗死的治療，本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備大鼠局灶性大腦中動脈缺血再灌注模型，以探討依達(dá)拉奉對腦缺血時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動物與分組 成年雄性Wistar大鼠36只，體重280～320 g，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham組)組、缺血+生理鹽水對照組(NS組)和腦缺血+依達(dá)拉奉干預(yù)組(依達(dá)拉奉組)。每組12只大鼠，6只動物取腦組織用于MDA、SOD活力的檢測，6只動物行腦組織病理切片用于免疫組化和TUNEL染色，檢測凋亡水平。

1.2 試劑 依達(dá)拉奉注射液由先聲藥業(yè)股份有公司提供(30 mg/20 ml);TUNEL試劑盒、caspase-3試劑盒購自北京中杉公司。

1.3 儀器 冰凍切片機(jī)顯微照相系統(tǒng)超低溫冰箱

2 方法

2.1 模型制作 參照Zea-longa法［1］，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，頸正中切口，在距頸總動脈(CCA)分叉處約5～8 mm處分別結(jié)扎頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)，并分離結(jié)扎頸內(nèi)動脈(ICA)的分支翼腭動脈，血管夾阻斷ICA的血流，將直徑為0.235 cm的尼龍線，肝素浸泡后經(jīng)CCA上切口(離分叉處約5～8 mm)，進(jìn)入CCA、ICA，插入深度約為18～20 mm，絲線扎緊CCA，固定尼龍線，依次關(guān)閉切口。術(shù)中及術(shù)后均注意保溫。缺血2 h后，拔出尼龍線10 mm恢復(fù)灌注，假手術(shù)組僅結(jié)扎頸總、頸外動脈。依達(dá)拉奉治療組于術(shù)前7 d至術(shù)后2 d給予依達(dá)拉奉(應(yīng)用生理鹽水稀釋成濃度1 mg/ml，劑量3 mg/kg)腹腔注入，2次/d。生理鹽水組每日兩次腹腔注射同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組不注射藥物。

2.2 標(biāo)本采集 每組取6只動物于術(shù)后48 h用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，剪開胸腔，暴露出心臟，經(jīng)左心室插管，以生理鹽水向左心室灌注，至右心房流出的沖洗液轉(zhuǎn)清后，改灌4%多聚甲醛至軀干僵硬時(shí)，立即斷頭取腦，于4%多聚甲醛緩沖液24 h，然后進(jìn)行石蠟包埋切片，用于檢測Caspase-3表達(dá)水平及神經(jīng)細(xì)胞凋亡。每組另6只取缺血側(cè)腦組織放入4℃生理鹽水，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成100 g/L的腦勻漿，用離心機(jī)3000r/min，離心15 min，取上清液用于檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。

2.3 MDA含量、SOD活力測定 以四己氧基丙烷為MDA標(biāo)準(zhǔn)品，用硫代巴比妥酸法測定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 g/L腦組織勻漿液100μl在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下反應(yīng)，以空白管調(diào)零，測定樣品熒光強(qiáng)度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織MDA含量。SOD活力測定采用改良的黃嘌呤氧化酶法，按試劑盒說明書操作，在550nm處比色。

2.4 免疫組化、細(xì)胞凋亡染色并計(jì)數(shù) caspase-3蛋白表達(dá)檢測采用SP法，抗體及SP試劑盒、DAB試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購于北京中杉公司。免疫組化反應(yīng)圖像半定量分析:每大腦個(gè)標(biāo)本于視交叉后相應(yīng)部位連續(xù)切片，每隔5張取1張，共取10張切片。每張切片在40倍物鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)視野，測定陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每組平均值。

3 結(jié)果

3.1 MDA含量、SOD活力 生理鹽水組及依達(dá)拉奉治療組大鼠腦組織勻漿中MDA含量較假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01)，而SOD活力明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)，同時(shí)依達(dá)拉奉治療組腦組織中MDA含量顯著低于生理鹽水組(P＜0.05)，而SOD活力顯著高于生理鹽水組(P＜0.05)，詳見表1。

表1 3組動物腦組織中MDA含量、SOD活力、caspase-3免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)的比較(個(gè)/400倍)

3.2 免疫組化 術(shù)后48 h梗死灶周圍腦組織可見caspase-3免疫陽性細(xì)胞，假手術(shù)組也可見少量caspase-3免疫陽性細(xì)胞，生理鹽水組caspase-3免疫陽性細(xì)胞顯著增多，依達(dá)拉奉治療組caspase-3免疫陽性細(xì)胞較生理鹽水組顯著減少(P＜0.05)。

3.3 腦組織切片細(xì)胞凋亡數(shù)測定 TUNEL染色發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征示胞體縮小，染色質(zhì)凝集，密度增高，呈塊狀或顆粒狀，胞核中棕色顆粒。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，假手術(shù)組凋亡細(xì)胞數(shù)(個(gè)/40倍物鏡視野)顯著低于生理鹽水組和依達(dá)拉奉治療組(P＜0.01)，依達(dá)拉奉治療組凋亡細(xì)胞數(shù)(個(gè)/40倍物鏡視野)顯著低于生理鹽水組(P＜0.05)。

4 討論

近年研究證實(shí)，氧自由基和活性氧在再灌注損傷中起主要作用。在缺血再灌注損傷過程中氧自由基(OFR)如:超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)等呈爆發(fā)性增加［2］，MDA 是脂質(zhì)過氧化的重要終產(chǎn)物之一，反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度;SOD是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶之一，反映了機(jī)體清除氧自由基的能力;正常情況下機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除保持著動態(tài)平衡，體內(nèi)SOD活性、MDA含量的變化可以反映機(jī)體清除自由基和抗氧化損傷的能力［3］。缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生的氧自由基可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，損傷生物膜(因含脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu))引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而改變它們的功能，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，線粒體腫脹破裂并誘發(fā)細(xì)胞凋亡［4］;神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血/再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，是腦缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡(delayed neuronal death，DND)的主要形式［5］，因此如果能阻止凋亡的發(fā)展，就有可能減輕腦缺血時(shí)腦損傷程度，縮小梗死范圍?，F(xiàn)已明確，細(xì)胞凋亡的發(fā)生是由基因調(diào)控的過程，目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在各種死亡信號刺激后發(fā)生的一系列級聯(lián)激活的主動性細(xì)胞死亡過程。caspase家族在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)，是執(zhí)行凋亡的最終途徑。其中caspase-3被認(rèn)為是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免，正常情況下，胞質(zhì)中的caspase-3以無活性的酶原形存在，細(xì)胞凋亡信號的出現(xiàn)可導(dǎo)致caspase-3在多種蛋白水解酶的作用下，發(fā)生裂解而活化。通過酶解滅活凋亡抑制物、酶解細(xì)胞外基質(zhì)及骨架蛋白、裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子等使細(xì)胞解體。因此如能有效抑制caspase-3的活性則可減緩細(xì)胞的凋亡。

依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，具有自由基清除和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，可以抑制腦細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞)的過氧化作用，本研究旨在探討依達(dá)拉奉對大鼠缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后大鼠腦組織MDA含量比假手術(shù)組顯著升高，SOD活力顯著下降，應(yīng)用依達(dá)拉奉治療后，依達(dá)拉奉組比生理鹽水組MDA含量明顯減少，SOD活性明顯回升，這說明依達(dá)拉奉有明顯抗脂質(zhì)過氧化及清除自由基的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［6］，依達(dá)拉奉治療組神經(jīng)元凋亡數(shù)比生理鹽水組顯著下降，同時(shí)依達(dá)拉奉治療組的caspase-3表達(dá)水平比生理鹽水組顯著下降，這說明依達(dá)拉奉能明顯抗脂質(zhì)過氧化并能有效對抗神經(jīng)元凋亡。

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