PERV基因?qū)Ｘi產(chǎn)仔數(shù)的影響

陶 勇，周 俊，任善茂，張紹祥，董曉君，高勤學(xué)

(1.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300;2.儀征市新集鎮(zhèn)獸醫(yī)站，江蘇 儀征 210095;3.淮安市楚州區(qū)獸醫(yī)站，江蘇 淮安 223200)

豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒 (Porcine endogenous retrovirus，PERV)是指以前病毒DNA形式整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制的反轉(zhuǎn)錄病毒，其在體外感染人源細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì)異種移植安全性的廣泛關(guān)注［1-2］。實(shí)際上，這些內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)常包含有突變成分，有提供抵制感染的保護(hù)作用，并且涉及到繁殖 過(guò) 程。2007 年， TAMU (TEXAS A＆M University)一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)綿羊en JSRVs對(duì)早期妊娠和受精卵著床具有重要作用，采用RNA干擾的方法，阻止en JSRVs基因的表達(dá)，會(huì)引起妊娠的終止［3］。我們以姜曲海豬為研究對(duì)象，檢測(cè)分析PERV囊膜基因env 3種通用基因型在姜曲海豬中存在情況，并進(jìn)一步分析不同基因型與姜曲海豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系，以期對(duì)姜曲海豬的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)豬

隨機(jī)選取有哺乳記錄的純種姜曲海豬60頭，采集耳組織樣，并收集每頭母豬的產(chǎn)仔記錄。

1.2 工具酶和試劑

Taq DNA聚合酶、蛋白酶K等購(gòu)自Promega公司，DNA Marker DL2000購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)。

1.3 耳組織DNA制備

耳組織采用USSTE裂解液與蛋白酶K消化，再用酚-氯仿抽提的方法制備DNA，DNA樣品溶于TE中，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)目前通用的 PERV-env基因分型方法［4］，合成了3對(duì)用于分型檢測(cè)的引物 env-A、env-B、env-C。 序 列:env-AF:5'-TGGAAAGATTGGCAA CAGCG-3';env-AR:5'-AGTGAATGTTAGGCTCAG TGG-3';env-BF:5'-TTCTCCTTTGTCAATTCCGG-3';env-BR:5'-TACTTTATCGGGTCCCACTG-3';env-CF:5'-CTGACCTGGATTAGAACTGG-3';env-CR:5'-ATGTTAGAGGATGGTCCTGG-3'。

1.5 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)在10μL體系中進(jìn)行，在無(wú)菌指形管中依次加入 1μL 耳組織 DNA、10×buffer 1μL、25mmol·L-1MgCl21μL、dNTPs 混合物 (2.5mmol each)0.8μL、上下游引物 (50 pmol)各 0.4μL、Taq DNA聚合酶 (50 U·μL-1)0.1μL，加無(wú)菌去離子水至10μL。94℃預(yù)變性4min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min;4℃保溫。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳

用1×TBE電泳緩沖液制備2%瓊脂糖凝膠，加 EB 至終濃度 0.5μg·mL-1，取 3μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，加溴酚蘭混勻。以5 V·cm-1的電壓進(jìn)行電泳，用紫外透射儀分析擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果和分析

2.1 PCR的檢測(cè)結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，片段長(zhǎng)度與所設(shè)計(jì)的片段大小一致。

各基因型頻率ABC為0.90(54個(gè)體數(shù))，AB為0.03(2個(gè)體數(shù))，AC為0.03(3個(gè)體數(shù))，O(PERV-env 3種亞型均未檢測(cè)到)為0.03(1個(gè)體數(shù))。絕大部分姜曲海豬個(gè)體內(nèi)均有 PERV-A、B、C型的存在，但有1個(gè)樣品未檢測(cè)到PERV-B型，1個(gè)樣品未檢測(cè)到PERV-C型，1個(gè)樣品3種亞型均未檢測(cè)到。

圖1 PERV-env 3種亞型PCR的檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同基因型間產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

由表1可知，在所統(tǒng)計(jì)的姜曲海豬胎次內(nèi)，AB、AC、O 3種基因型的產(chǎn)仔數(shù)高于ABC型的產(chǎn)仔數(shù)。PERV的存在可能有降低豬產(chǎn)仔數(shù)的趨勢(shì)。

表1 PERV-env基因型間的產(chǎn)仔數(shù)

3 小結(jié)和討論

檢測(cè)結(jié)果顯示，在姜曲海豬所有被檢樣品中，絕大部分個(gè)體均存在PERV-env的3種類型，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)一致［5-6］。但潘漢世［7］在廣西巴馬小型香豬群體中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)C亞型，這可能與廣西巴馬小型香豬是由于長(zhǎng)期近親交配形成的封閉群體有關(guān)。

PERV對(duì)豬繁殖性能的影響至今尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。但中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)［8］的研究表明，繁殖力高的豬品種如梅山豬其PERV拷貝數(shù)普遍高于其他品種，這是否意味著PERV在豬繁殖過(guò)程中起著重要的作用。本試驗(yàn)分析了PERV-env基因型對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的影響，結(jié)果表明，PERV-env 3種亞型中，缺失型個(gè)體的產(chǎn)仔數(shù)高于3種亞型全檢出的個(gè)體。由于條件限制，本試驗(yàn)中所檢測(cè)的姜曲海豬個(gè)體數(shù)還較少，可靠性較低，今后可以在此研究基礎(chǔ)上擴(kuò)大檢測(cè)群體或其他地方品種豬上來(lái)驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果。

［1］Patience C，Takeuchi Y，Weiss R A.Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs［J］.Nat Med，1997，3(3):282-286.

［2］Joachim Denner.Recombinant porcine endogenous retroviruses(PERV-A/C):a new risk for xenotransplantation ［J］.Arch Virol，2008，153:1421-1426.

［3］Jonsson S R.，LaRue R S.The restriction of zoonotic PERV transmission by human ［J］.APOBEC3G PLoS ONE，2007，2(9):893.

［4］Sarah K P，David A M，Peter J M，et al.Transient transmission of porcine endogenous retrovirus to fetal lambs after pig islet tissue xenotransplantation ［J］.Immunology and Cell Biology，2007，85:238-248.

［5］徐斯日古楞，呂茂民，吳健敏，等.中國(guó)巴馬小型豬中豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè) ［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24(6):79-81.

［6］Bosch S，Arnauld C，Jestin A.Study of full length porcine endogenous retrovirus genomes with envelope gene polymorphism in a specific-pathogen-free large white swine herd ［J］.Jviol，2000，74(18):8575.

［7］潘漢世.廣西巴馬小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)及分子生物學(xué)特性的研究 ［D］.南寧:廣西大學(xué)，2007.

［8］Li Z，Ping Y.Phylogenetic analysis of porcine endogenous retrovirusesexpressed in Chinese pigs based on envelope sequences ［J］.Transplant Proc，2006，38(7):2252-2257.