枯草芽孢桿菌a1所產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性研究

鐘嘯萍，熊智強(qiáng)，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江 杭州 310014)

真菌引起的植物病害位居植物3類病害之首，其危害大于細(xì)菌病害和病毒病害［1］。目前對植物病害的防治普遍采用速克靈、百菌清、多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥［2-3］，而化學(xué)農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的毒害、對環(huán)境的污染、使有害物產(chǎn)生抗藥性的問題至今仍難以解決?；瘜W(xué)農(nóng)藥的殘留問題，更是極大的危害人類健康，引起了食品安全的信任危機(jī)。開發(fā)新型的廣譜、高效、低毒的生物農(nóng)藥被認(rèn)為是一條解決上述問題的有效途徑。

本實(shí)驗室以順丁烯二酸酐為基礎(chǔ)碳源，從土壤中分離得到的1株對灰霉病菌具有較強(qiáng)抑制作用的菌株a1，發(fā)現(xiàn)其具有較好的潛力開發(fā)成生物農(nóng)藥，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和16 SrDNA序列分析，確定其為枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis［4］。之后又對a1菌株所產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究［5］。為了明確a1菌株發(fā)酵液的保存環(huán)境及分離純化活性物質(zhì)的條件，我們對a1菌株發(fā)酵液在不同溫度，酸堿和光照條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了測定，其結(jié)果為開發(fā)新型生物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

實(shí)驗室自行篩選的枯草芽孢桿菌a1(Bacillus subtilis a1)。

1.1.2 供試病原菌

番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea)和油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)均由實(shí)驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:土豆200 g，葡萄糖200 g，水1 000 mL，pH自然。種子液培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDA液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

從PDA斜面上刮下2環(huán)枯草芽孢桿菌a1到種子液培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)96 h。

1.2.2 抑菌活性的測定

采用生長速率法測定［6］。發(fā)酵結(jié)束后取30 mL發(fā)酵液置于15 000 r·min-1的離心機(jī)上離心 10 min，然后取上清液稀釋10倍。取1 mL稀釋液與9 mL的融化的PDA固體培養(yǎng)基混勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，接種直徑為6 mm的供試病原菌菌餅，2～3 d后，測量菌圈直徑，計算抑菌率。用十字交叉法［7］測菌圈直徑。以無菌水作對照，做3個平行取平均值。

菌圈直徑 (mm)=實(shí)際測得菌圈直徑 -6，抑菌率 (%)=(對照菌圈直徑-處理菌圈直徑)/對照菌圈直徑×100。

1.2.3 確定抗菌物質(zhì)產(chǎn)生部位試驗

從PDA斜面上刮下2環(huán)枯草芽孢桿菌a1到種子液培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)。發(fā)酵24 h后，取出25 mL發(fā)酵液用15 000 r·min-1離心機(jī)離心10 min。取上清液加入25 mL pH值為6.2的磷酸緩沖液稀釋后進(jìn)行抑菌活性的測定。收集菌體，加入50 mL pH值為6.2的磷酸緩沖液，用超聲破碎儀進(jìn)行破碎。然后再用15 000 r·min-1離心機(jī)離心10 min，取上清液測定抑菌活性。按上述方法分別測定發(fā)酵24，48，72和96 h時胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物的抑菌活性。

1.2.4 熱穩(wěn)定性試驗

將發(fā)酵上清液分別置于60，80，100，120℃下處理20 min，然后冷卻至室溫，與室溫下的發(fā)酵上清液作比較，用生長速率法測定抑菌活性［8］。

1.2.5 pH值穩(wěn)定性試驗

分別將發(fā)酵上清液的p H值從1調(diào)到14，處理12 h后，將這些發(fā)酵上清液離心10 min，15 000 r·min-1，然后將 pH調(diào)回初始 pH(pH值為6)，用生長速率法測定抑菌活性［9］。

1.2.6 紫外線穩(wěn)定性試驗

將發(fā)酵上清液置于紫外燈下照射1，6，12和24 h，與未照射紫外光的發(fā)酵上清液作比較，用生長速率法測定抑菌活性。

1.2.7 光照穩(wěn)定性試驗

將發(fā)酵上清液置于日光燈下照射1，6，12和24 h，與未照射的發(fā)酵上清液作比較，用生長速率法測定抑菌活性。

1.2.8 遺傳穩(wěn)定性試驗

將a1菌株在PDA斜面上每隔2 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)培養(yǎng)8代，然后每代分別發(fā)酵，最后測定各代發(fā)酵液的抑菌活性［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌物質(zhì)產(chǎn)生部位的確定

從表1看出，枯草芽孢桿菌a1胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物均有抑菌活性，胞外產(chǎn)物的抗菌活性明顯高于胞內(nèi)產(chǎn)物。所以枯草芽孢桿菌a1所產(chǎn)的抗菌物質(zhì)主要存在于胞外。胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物有可能是不同的物質(zhì)，這需要在進(jìn)一步實(shí)驗中證實(shí)。

2.2 熱穩(wěn)定性

a1菌株發(fā)酵液在不同溫度下處理20 min，隨著溫度的升高，發(fā)酵液的顏色變深，從室溫時的淡黃色變成120℃時的黃褐色。從表2可以看出，a1菌株發(fā)酵液在60℃和80℃下處理20 min的抑菌活性比室溫下有所下降，但仍保持有較高的抑菌活性。發(fā)酵液經(jīng)過100℃處理，抑菌率有較大幅度的下降，對菌核病菌和灰霉病菌有一定的抑菌效果，在120℃處理下則完全喪失了抑菌活性。結(jié)果表明a1菌株的抗菌物質(zhì)在80℃以下時穩(wěn)定性較好。

表1 確定抗菌物質(zhì)產(chǎn)生部位的試驗結(jié)果

表2 熱穩(wěn)定性的試驗結(jié)果

2.3 pH穩(wěn)定性

a1菌株發(fā)酵上清液在pH＜5時產(chǎn)生沉淀，隨著酸性的增大，液體渾濁度也增大，離心取沉淀后的上清液的抑菌活性明顯降低。沉淀加水后可重新溶解，且溶液經(jīng)檢測后有一定的抑菌活性。當(dāng)發(fā)酵上清液pH＞8時，上清液顏色變深，沒有產(chǎn)生沉淀，抑菌活性也大幅度下降。在pH為6和7時，發(fā)酵上清液顏色沒有變化，也沒有沉淀產(chǎn)生，而且有較高的抑菌活性。表3結(jié)果表明，a1菌株所產(chǎn)活性物質(zhì)在堿性條件下不穩(wěn)定，但具有很強(qiáng)的耐酸性。

2.4 紫外線穩(wěn)定性

由表4可以看出，a1菌株的發(fā)酵液在紫外光下照射6 h后，它的抑菌活性沒有較大的改變。當(dāng)紫外照射發(fā)酵液12 h和24 h后，活性物質(zhì)對菌核病菌和灰霉病菌的抑菌率明顯下降。表明a1菌株所產(chǎn)物質(zhì)在紫外光照下不夠穩(wěn)定。

2.5 光照穩(wěn)定性

從表5可以看出，a1菌株所產(chǎn)活性物質(zhì)在光照條件下抑菌活性變化不大，與未光照時的抑菌活性相差無幾，表明a1菌株所產(chǎn)活性物質(zhì)在光照下較穩(wěn)定。

2.6 遺傳穩(wěn)定性

從表6可以看出，a1菌株連續(xù)培養(yǎng)8代，其發(fā)酵所產(chǎn)物質(zhì)對菌核病菌和灰霉病菌的抑菌率變化不大，到第8代仍有較高的抑菌活性，而且在實(shí)驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)每代菌的形態(tài)特征都相同，無變化，表明a1菌株在連續(xù)傳代過程中比較穩(wěn)定。

表3 pH穩(wěn)定性試的驗結(jié)果

表4 紫外線穩(wěn)定性的試驗結(jié)果

表5 光照穩(wěn)定性的試驗結(jié)果

表6 遺傳穩(wěn)定性的試驗結(jié)果

3 小結(jié)和討論

實(shí)驗結(jié)果表明，a1菌株的發(fā)酵液在酸性條件下能產(chǎn)生沉淀，且沉淀具有抑菌活性，這一特性為對活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化提供了重要依據(jù)，但發(fā)酵液中的活性物質(zhì)是否全部轉(zhuǎn)化為沉淀，還需要進(jìn)一步研究。

a1菌株所產(chǎn)的抗菌物質(zhì)能耐80℃的高溫，在光照和中性條件下活性穩(wěn)定，在紫外光照射和堿性條件下不穩(wěn)定。在保存a1菌株的發(fā)酵液時不需要避光，在分離純化抗菌活性物質(zhì)時應(yīng)注意避免在堿性條件和超過100℃的高溫條件下提取?？莶菅挎邨U菌a1的遺傳性能相當(dāng)穩(wěn)定，連續(xù)傳8代其所產(chǎn)抗真菌物質(zhì)活性沒有下降，這表明a1菌株具有作為發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)菌的潛力。這些特性對以后研究該抗菌物質(zhì)開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

Bacillus subtili所產(chǎn)的抗菌物質(zhì)種類的國內(nèi)外報道很多，主要是一些高分子量蛋白類的抗菌物質(zhì)［11］和伊枯草菌素之類的低分子量的抗菌肽［12-14］。而目前對這些抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性研究也很多，王啟軍等［15-16］研究的不同枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的抗菌物質(zhì)都是脂肽類化合物具有耐酸堿，熱穩(wěn)定的特性。從類芽孢桿菌菌株B69發(fā)酵液中提取出 2種子新的抗菌物質(zhì) Pelgipeptin A和Pelgipeptin B，這2種子物質(zhì)在60℃時處理2 h和pH值 1～8范圍內(nèi)抗菌活性保持穩(wěn)定［17］。Hammami［18］研究的枯草芽孢桿菌14 B所產(chǎn)的類蛋白抗菌物質(zhì)可耐121℃高溫，在pH 1到8范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的抗菌活性。本研究的結(jié)果與Xue-Chang Wu的結(jié)果有相似之處，都不耐堿和100℃以上的高溫，因此，a1菌株所產(chǎn)抗菌物質(zhì)有可能是Pelgipeptin A和Pelgipeptin B，但目前的試驗還無法判斷a1菌株所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的種類，也可能是還未報道過的新抗真菌化合物，下一步研究重點(diǎn)集中在分離純化抗真菌活性物質(zhì)及鑒定它的分子結(jié)構(gòu)。

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