魚類病毒病的研究進(jìn)展及其展望

馮東岳 溫周瑞

1.全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,北京 100125;2.湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所,武漢 430071

近年來(lái),隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,其在農(nóng)業(yè)產(chǎn)值中所占的比重也逐年上升,已成為中國(guó)農(nóng)業(yè)的四大支柱產(chǎn)業(yè)（糧食、肉類、水產(chǎn)和禽蛋）之一。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì),2009年我國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值11 445.13億元,漁業(yè)產(chǎn)值占農(nóng)林牧漁業(yè)總產(chǎn)值的9.32%,比2008年增長(zhǎng)0.34%。2009年我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量為5 116.40萬(wàn)t,其中養(yǎng)殖產(chǎn)量為3 621.68萬(wàn)t,占總產(chǎn)量的70.79%,可見(jiàn)養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要支柱。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖密度的不斷增大,發(fā)生病害的幾率也逐漸加大,每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)100～150億元,病害已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素之一。

水生動(dòng)物的疾病包括病毒病、細(xì)菌病、真菌病和寄生蟲病等。其中病毒病的病原體微小、在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、潛伏期長(zhǎng),導(dǎo)致病毒病癥狀復(fù)雜多變、傳染性強(qiáng)、死亡率高、難以防控,嚴(yán)重危害水生動(dòng)物的養(yǎng)殖,易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織OIE要求各成員國(guó)每年必須申報(bào)的水生動(dòng)物疫病絕大部分是病毒病,如2010年要求必須報(bào)告的水生動(dòng)物疫病有25種,其中病毒病16種、寄生蟲病6種、真菌病3種。因此,水生動(dòng)物病毒病引起的危害越來(lái)越嚴(yán)重,已受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

1 主要魚類病毒

自從Wolf分離到第一株魚類病毒（傳染性胰腺壞死病毒）[3]以來(lái),迄今見(jiàn)報(bào)道的魚類病毒已超過(guò)70種,在絕大多數(shù)動(dòng)物病毒科中都有分布[4]。其中有30多種魚類病毒分離成功,基本上屬于皰疹病毒科、呼腸孤病毒科、虹彩病毒科、副粘病毒科、雙RNA病毒等,表1列舉了一些對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害較嚴(yán)重的病毒。

表1 主要魚類病毒及其宿主

2 部分魚類病毒病的臨床癥狀

2.1 斑點(diǎn)叉尾鮰病毒病

病魚雙眼突出,魚體發(fā)黑、鰓發(fā)白,繼而表皮和鰭條基部充血,腹部膨大,還表現(xiàn)為行為異常,嗜睡,旋轉(zhuǎn)或垂直懸掛于水中,最后下沉死亡。解剖后可見(jiàn)肌肉充血,體內(nèi)有黃色滲出物,肝、脾、腎充血或腫大,胃內(nèi)無(wú)食物,后腎損傷較嚴(yán)重并出現(xiàn)水腫,最典型的組織病理變化是腎管和腎間組織的廣泛性壞死。

2.2 草魚出血病

病魚鰓充血、體發(fā)黑、眼突出,體表、口腔、鰓蓋和鰭條基部可見(jiàn)出血,撕開(kāi)表皮可見(jiàn)肌肉點(diǎn)狀或塊狀出血。解剖后可見(jiàn)腸系膜、肝、脾、腎等內(nèi)臟出血,有的病魚的肝因失血而出現(xiàn)發(fā)黃癥狀。

2.3 傳染性造血器官壞死病

該病暴發(fā)時(shí),稚魚和幼魚的死亡率突然升高。病魚表現(xiàn)為昏睡、頂水,行為異常,狂奔亂竄、打轉(zhuǎn)。病魚的眼球突出且變黑,鰓蒼白,腹部膨脹,鰭基部和頭部之后的側(cè)線處皮下出血,較為典型的特征是肛門拖一條不透明或棕褐色的假管型黏液樣糞便。

2.4 傳染性胰腺壞死病

病魚體色發(fā)黑,眼球突出,腹部膨大,腹部及鰭基部充血,鰓呈淡紅色,肛門處常拖有一條線狀黏液便。病魚還表現(xiàn)為游動(dòng)失調(diào),常作垂直回轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng),一會(huì)兒沉入水底,一會(huì)兒又重復(fù)回轉(zhuǎn)游動(dòng),直至死亡。解剖后可見(jiàn)消化道內(nèi)沒(méi)有食物,黏膜變性、壞死,肝、脾、腎水腫并異常蒼白,胰腺組織嚴(yán)重壞死。對(duì)胰臟組織進(jìn)行超薄切片,可觀察到在細(xì)胞的胞漿中有包涵體存在。

2.5 真鯛虹彩病毒病

病魚未見(jiàn)異常則逐漸死亡。解剖后可見(jiàn)脾臟和腎臟腫大;脾臟和心臟組織內(nèi)出現(xiàn)真鯛虹彩病毒病常見(jiàn)的肥大細(xì)胞,但數(shù)量不多。病理組織學(xué)變化表現(xiàn)為脾髓、腎臟造血組織、肝臟有壞死病灶形成,各臟器血管和心臟有細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生。

2.6 錦鯉皰疹病毒病

病魚停止游泳,眼凹陷,皮膚上出現(xiàn)蒼白色的斑塊與水皰,鰓出血、黏液增多、組織壞死且有大小不等的白色斑塊,鱗片有血絲,體表黏液增多且變稠。病魚一般在出現(xiàn)癥狀后24～48 h內(nèi)死亡。

2.7 鯉春病毒血癥病

該病通常于春季（水溫20℃以下）暴發(fā),引起幼魚和成魚死亡。發(fā)病時(shí),病魚行為失常,無(wú)目的地漂游,呼吸困難,體色發(fā)黑,眼球突出,腹部膨大,肛門紅腫,體表（皮膚、鰭條、口腔）和鰓充血。解剖時(shí),全身出血、水腫、有大量的血性腹水,消化道出血,心、腎、鰾、肌肉出血并出現(xiàn)炎癥,最常見(jiàn)的是鰾內(nèi)壁出血。

2.8 病毒性出血性敗血癥

急性感染者表現(xiàn)為嗜睡,外觀色暗,實(shí)質(zhì)器官和肌肉出血以及游泳障礙和死亡。慢性感染時(shí)病魚表現(xiàn)冷漠或持續(xù)性死亡。解剖病魚可見(jiàn)肌肉、腸道出血,腎臟壞死,部分病魚腹腔中有腹水。

3 魚類病毒病的檢測(cè)和鑒定

目前,用于魚類病毒病檢測(cè)和鑒定的技術(shù)主要包括電子顯微鏡技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和基因芯片技術(shù)等。

3.1 電子顯微鏡技術(shù)

目前,電鏡用于水生動(dòng)物病毒的研究,其視野并不局限于觀察細(xì)胞病變、病毒的形態(tài)大小和分類,已擴(kuò)展到了解病毒的感染、復(fù)制機(jī)理和病毒的形態(tài)發(fā)生等[5]。病毒囊膜的有無(wú)是水生動(dòng)物病毒的基本結(jié)構(gòu)及分類特征之一,對(duì)此,電鏡觀察能提供直接證據(jù),如姜明等[6]用電子顯微鏡對(duì)一種真鯛球形病毒的形態(tài)及細(xì)胞病理學(xué)進(jìn)行了觀察。徐洪濤等[7]通過(guò)電鏡觀察到了患虹彩病毒病的大菱鲆鰭、鰓、腎、脾、肝、胰、心及腦組織中的虹彩病毒病原,從而進(jìn)行初步確診。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是病毒學(xué)研究的基礎(chǔ),也是病毒病診斷的經(jīng)典方法之一。目前已建立的魚類細(xì)胞系很多,已有30余種魚類病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中分離成功。國(guó)外已有利用培養(yǎng)細(xì)胞研究淋巴囊腫病毒（屬于虹彩病毒科）的報(bào)道。國(guó)內(nèi)左文功等[8]在1981年就開(kāi)始進(jìn)行草魚腎臟組織單層細(xì)胞的培養(yǎng),并利用此細(xì)胞分離到了草魚出血病的病毒顆粒。張奇亞等[9]通過(guò)建立呈上皮細(xì)胞形態(tài)的草魚椎骨間質(zhì)細(xì)胞系GCVB,表明GCVB細(xì)胞對(duì)蛙虹彩病毒中國(guó)分離株RGV9506及蛙虹彩病毒美國(guó)分離株FV3敏感,可引起不同程度的病變。呂宏旭等[10]利用牙鲆鰓細(xì)胞系進(jìn)行了養(yǎng)殖牙鲆淋巴囊腫病毒的分離及培養(yǎng)。曾令兵等[11]采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒技術(shù)從患出血病的斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)分離到一株新病毒,經(jīng)人工感染試驗(yàn)、電鏡觀察、理化特性試驗(yàn)以及病毒基因組分析,確認(rèn)為斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒。

3.3 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)包括中和實(shí)驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。中和實(shí)驗(yàn)是魚類病毒鑒定中使用最為普遍的免疫學(xué)技術(shù),已成為魚類病毒鑒定的經(jīng)典方法,目前已廣泛應(yīng)用于IPNV、PFRV、SVCV、VHSV、IHNV及CCV等的常規(guī)診斷。相比較而言,熒光抗體技術(shù)和ELISA可在幾小時(shí)之內(nèi)得到結(jié)果,從而可以滿足快速診斷的需要。熒光抗體技術(shù)目前已在 IPNV、VHSV、CCV、PFRV、SVCV及IHNV等的檢測(cè)中普遍使用,特別是若把細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和熒光抗體技術(shù)結(jié)合起來(lái),則可顯著提高熒光抗體技術(shù)的敏感性。ELISA目前亦用于IPNV、VHSV、CCV、PFRV 及 SVCV 的檢測(cè)。ELISA靈敏度高,特異性好,能同時(shí)進(jìn)行大樣本檢測(cè)。江育林等[12]用ELISA達(dá)到了快速檢測(cè)虹鱒的傳染性胰臟壞死病病毒的目的。

3.4 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,是一項(xiàng)DNA在體外合成的放大技術(shù)。根據(jù)PCR原理,人們研究出多種不同的PCR技術(shù),包括常規(guī)PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、套式PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)等,并且已經(jīng)成功運(yùn)用于檢測(cè)細(xì)菌和病毒。鄧敏等[13]根據(jù)真鯛虹彩病毒（RSIV）核苷酸還原酶小亞單位（RNRS）基因的高度保守區(qū)探索性地設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物,報(bào)道了鱖魚病毒的PCR檢測(cè)方法,可檢測(cè)到0.1 pg病毒DNA。苗素英等[14]用PCR方法檢測(cè)到虎紋蛙病毒中有虹彩病毒的存在。呂玲等[15]對(duì)一種蛙病毒進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增后,通過(guò)比較酶切圖譜、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,證明該病毒為蛙虹彩病毒屬的一種。范萬(wàn)紅等[16]利用PCR的檢測(cè)方法,擴(kuò)增蛙病毒屬衣殼蛋白（MCP）410 bp的DNA片段,用該方法從患“紅脖子”病的甲魚中分離的病毒毒株（9701株）中擴(kuò)增出特異性的片段,經(jīng)比較分析初步判定9701株屬于蛙病毒屬。

3.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是一種高通量、快速、平行核酸序列測(cè)定及定量分析技術(shù)。它是在一塊大小不等的載玻片、硅片、尼龍膜等載體材料上,以大規(guī)模陣列的形式排布了不同的核酸探針,形成可以與目的靶分子相互作用,并進(jìn)行反應(yīng)的固相表面。通過(guò)與標(biāo)記核酸分子雜交,用激光共聚焦熒光掃描儀或其他檢測(cè)手段檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)弱而判斷樣品中靶分子的組成及數(shù)量,該技術(shù)可以將大量的核酸分子同時(shí)固定在載體上,形成高通量檢測(cè)分析的能力,在大量樣品和多種病毒的檢測(cè)分析中有很大優(yōu)勢(shì)。許拉等[17]采用基因芯片技術(shù)原理,達(dá)到了在一個(gè)載體上同時(shí)檢測(cè)2個(gè)樣品和12種水生動(dòng)物病毒的目的。這一技術(shù)在大批量病毒快速檢測(cè)中應(yīng)用得非常廣泛。

4 魚類病毒病的防治

4.1 免疫預(yù)防

由于病毒病目前尚無(wú)較好的治療辦法,因而免疫接種就成為預(yù)防病毒病暴發(fā)、控制病毒病蔓延的主要手段。目前,國(guó)外已有數(shù)十種魚類病毒病疫苗商品化,而國(guó)內(nèi)魚類病毒病疫苗研究仍處于試驗(yàn)階段,尚無(wú)商品化疫苗。魚類病毒病疫苗主要有滅活苗和弱毒苗2種。滅活疫苗研究較多,包括IPNV滅活苗、VHSV滅活苗、SVCV滅活苗及GCRV滅活苗等。弱毒苗中天然弱毒株很少,目前僅有一株自河鱸中分離到的IPNV,它對(duì)虹鱒安全無(wú)害,而且具有良好的免疫原性。弱毒苗能通過(guò)自然感染途徑進(jìn)入魚體,除可誘導(dǎo)體液抗體產(chǎn)生外,還能產(chǎn)生局部免疫,因而免疫效果較好。但是,由于弱毒株具有回復(fù)突變的可能,因而在安全性上遠(yuǎn)不如滅活苗。

4.2 藥物防治

有關(guān)魚類病毒病的化學(xué)藥物防治的資料不多。目前廣泛采用的是一種有機(jī)碘制劑（PVP）,已有資料表明,它能降低患傳染性造血器官壞死癥的紅點(diǎn)鮭幼魚的死亡率。據(jù)報(bào)道,PVP能有效破壞IHNV、IPNV和VHSV,因而常用于魚卵的消毒,但若病毒存在于卵膜內(nèi),用PVP處理也無(wú)效。此外,亦有資料表明,氯化銨可以抑制IPNV在CHSE-214細(xì)胞中增殖,苯丙咪唑鈉可抑制細(xì)胞的增殖,但均未進(jìn)行魚體試驗(yàn)。此外,天然植物藥物具有廣譜高效的抗病毒效果,開(kāi)發(fā)天然植物抗病毒藥物,是未來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病毒病防控技術(shù)研究的重要方向,且對(duì)于水環(huán)境安全、水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及人類健康有重要意義。

4.3 嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度

限制把疫區(qū)的魚運(yùn)到非疫區(qū)是控制病毒傳播的重要方法之一。因?yàn)橐邊^(qū)的魚,不管是患病魚,還是疫病流行后的存活魚,體內(nèi)的精液及卵液,多數(shù)都帶有病毒,一旦被引入非疫區(qū)的易感魚群,就會(huì)造成易感魚群的大量死亡。因此,在魚被引入新區(qū)之前,應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫。有鑒于此,不少國(guó)家已制定并執(zhí)行了魚病法,制定了一些相應(yīng)的有關(guān)魚類病原體檢測(cè)和鑒定的程序。中國(guó)頒布的動(dòng)物檢疫條例中也包括了魚?。ㄖ饕遣《静。┑臋z疫,這標(biāo)志著魚類病毒的研究進(jìn)入了一個(gè)全新的階段。

5 魚類病毒病研究展望

今后魚類病毒病研究方向主要是快速診斷試劑盒的研制和疫苗的研發(fā)。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)可以達(dá)到早期和快速診斷的目的,隨著對(duì)魚類病毒分子生物學(xué)研究的不斷深入,尤其是DNA分離技術(shù)的提高、PCR技術(shù)的日趨完善、各種探針標(biāo)記方法的發(fā)展,使得核酸檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各種病毒更為方便、安全、快捷,為快速診斷試劑盒的研制提供了技術(shù)基礎(chǔ)。同時(shí),由于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,也為建立有效控制水生動(dòng)物病毒病提供了新的方法和途經(jīng)。例如,對(duì)部分魚類病毒的基因組結(jié)構(gòu)已闡明,其編碼蛋白的性質(zhì)和功能也被初步揭示,這為定向抗病毒育種技術(shù)研究、抗病毒藥物篩選與應(yīng)用等奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

從長(zhǎng)遠(yuǎn)看,研發(fā)免疫保護(hù)效果好的滅活疫苗以及研究新技術(shù)疫苗,如DNA疫苗、基因工程亞單位疫苗、載體表達(dá)口服疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等,是未來(lái)魚類疫苗研制的發(fā)展方向。

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