殼聚糖水凝膠的制備工藝對其吸附蛋白質(zhì)的影響

錢俊青,呂堅方

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310032)

殼聚糖(chitosan,CTS)是甲殼素(chitin)經(jīng)脫乙?；幚砗蟮漠a(chǎn)物,是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖單體通過β-1,4-糖苷鍵連接起來的直鏈狀高分子化合物[1-2].殼聚糖具有良好的生物相容性和豐富的表面基團的優(yōu)點可替代纖維素、葡聚糖等作為凝膠的載體,殼聚糖凝膠相比纖維素、二乙氨基葡聚糖凝膠等,克服了價格昂貴,合成和再生較復(fù)雜的缺點[3-6],因而應(yīng)用于生物活性蛋白的分離前景廣闊,已成為生物化工研究的熱點,唐振興等[7]合成一種采用戊二醛交聯(lián)并去除過量醛基的方法制備出了殼聚糖為載體的生物凝膠,具有良好的分離效果;黃麗等[8]以殼聚糖凝膠為載體制備了一種新型的低密度脂蛋白吸附劑,該吸附劑同時利用疏水作用和靜電作用對血漿中的膽固脂蛋白進行吸附,能有效的降低血漿中膽固醇的含量.不同的交聯(lián)劑對殼聚糖有不同的影響,為了考察殼聚糖本身的吸附性能,本實驗采用殼聚糖在酸性和堿性的水溶液中制備出不引進有機交聯(lián)劑的殼聚糖水凝膠,用于蛋白質(zhì)及酶的吸附,考察了不同殼聚糖水凝膠制備工藝對蛋白吸附性能的影響,并初步研究了純水淋洗的吸附特征.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

原料和試劑:甲殼素(食用級),牛血清蛋白(電泳單點純),α-淀粉酶(食品級),醋酸 、磷酸 、鹽酸和NaOH(均為化學(xué)純).

套式恒溫器,機械攪拌機,恒溫水浴槽,紫外-可見分光光度計.

1.2 實驗原理與方法

甲殼素(chitin)脫乙酰度的測定:根據(jù)文獻(xiàn)[9],用堿量法.

蛋白質(zhì)濃度的測定:在280 nm波長下,用紫外光度法測定[10].

酶活力測定:根據(jù)文獻(xiàn)[11],用終點色對比法進行測定.

1.3 實驗步驟

1.3.1 殼聚糖的制備

殼聚糖由甲殼素與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的NaOH反應(yīng)而得,反應(yīng)溫度控制在110℃左右,不同的反應(yīng)時間下制得不同脫乙酰度的殼聚糖.

1.3.2 殼聚糖水凝膠的制備

將制得的殼聚糖溶于酸性水溶液中,再滴入堿性水溶液中得粒狀殼聚糖水凝膠,最后用水洗至中性備用[12].

1.3.3 殼聚糖水凝膠吸附實驗

將殼聚糖水凝膠裝入分離柱;蛋白或酶上柱后,用蒸餾水洗脫,洗出液每2 mL收集一次,逐次承接,洗出液在280 nm下進行紫外測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖水凝膠用于牛血清蛋白吸附

將不同性能的殼聚糖水凝膠裝入分離柱;牛血清蛋白溶液上柱后,收集洗出液,每2 mL一次,逐次承接,洗出液在280 nm下進行紫外測定.

2.1.1 酸性水溶液對殼聚糖水凝膠吸附性能的影響

將殼聚糖溶于不同的酸性水溶液(HAc,HCl,H3PO4)中,再將殼聚糖酸溶液滴入堿液中得粒狀殼聚糖水凝膠,再按實驗步驟1.3.3檢測殼聚糖水凝膠的吸附性能, 結(jié)果如圖1 所示.

圖1 不同酸性水溶液中制備的粒狀殼聚糖水凝膠對牛血清蛋白的吸附Fig.1 Effect of kinds of acids on the absorption ability of the chitosan gel for BSA

從圖1可知,使用醋酸和鹽酸制備的殼聚糖水凝膠的分離效果較好,磷酸效果較差,且使用醋酸的效果稍好于鹽酸.若以蒸餾水為洗脫液,從分離前的洗柱情況看,使用醋酸制得殼聚糖粒狀水凝膠比用鹽酸制得的殼聚糖粒狀水凝膠易于洗至平衡,而Ac-比Cl-大,據(jù)此推測殼聚糖在此主要起凝膠分離作用.從分離效果和分離前的柱洗情況考慮,選用醋酸作為制備殼聚糖水凝膠的酸介質(zhì)較適.

2.1.2 醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對殼聚糖水凝膠吸附性能的影響

將殼聚糖溶于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的醋酸水溶液中(1%,2%,3%),再將殼聚糖酸溶液滴入堿液中得粒狀殼聚糖水凝膠,再按實驗步驟1.3.3檢測殼聚糖水凝膠的吸附性能,結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同的醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下制得的粒狀殼聚糖水凝膠對牛血清蛋白的分離Fig.2 Effect of the content of acid on the absorption ability of the chitosan gel for BSA

從圖2可知,2%醋酸下制得殼聚糖粒狀凝膠對牛血清蛋白的分離效果最好.

2.1.3 殼聚糖質(zhì)量濃度對殼聚糖水凝膠吸附性能的影響

將殼聚糖(2～6 g)溶于100 mL醋酸中,再將殼聚糖酸溶液滴入堿液中得粒狀殼聚糖水凝膠,再按實驗步驟1.3.3檢測殼聚糖水凝膠的吸附性能,結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同殼聚糖質(zhì)量濃度的殼聚糖粒狀凝膠對牛血清蛋白分離的影響Fig.3 Effect of chitosan content on the absorption ability of the chitosan gel for BSA

從圖3可知,殼聚糖質(zhì)量濃度為0.04 g/mL時分離效果最好,殼聚糖過低和過高都會使殼聚糖粒狀水凝膠對牛血清蛋白的分離性能降低.因而選用0.04g/mL的殼聚糖含量為最佳工藝參數(shù).

2.1.4 殼聚糖脫乙酰度對殼聚糖水凝膠吸附性能的影響

將不同脫乙酰度(68.0%,72.0%,86.0%,88.8%,95.0%)的0.04 g/mL的殼聚糖醋酸溶液滴入堿液中得粒狀殼聚糖凝膠,再按實驗步驟1.3.3檢測殼聚糖水凝膠的吸附性能,結(jié)果如圖4所示.

從圖4可知,脫乙酰度為88.8%的殼聚糖粒狀水凝膠對牛血清蛋白的分離效果較好,脫乙酰度太高、太低均不理想,圖4還表明,隨著脫乙酰度增大,洗脫變難,即吸附現(xiàn)象變得越發(fā)嚴(yán)重.故選用脫乙酰度為88.8%為最佳最佳工藝參數(shù).

通過對制備殼聚糖粒狀水凝膠時酸性水溶液、醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量濃度和殼聚糖脫乙酰度四個因素的考察,得出了脫乙酸度為88.8%,質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的殼聚糖在2%醋酸下制得的粒狀殼聚糖水凝膠對蛋白的分離能力最強.

圖4 不同脫乙酰度的殼聚糖粒狀凝膠對牛血清蛋白分離的影響Fig.4 Effect of the degree of deacetylation of chitosan on the absorption ability of the chitosan gel for BSA

2.2 殼聚糖水凝膠對α-淀粉酶的分離純化

為了說明殼聚糖水凝膠既有良好的分離性能又能使被分離物質(zhì)的生物活性盡可能保持,以過柱前后的α-淀粉酶活性變化來評價殼聚糖水凝膠.

將脫乙酰度為88.8%,質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的殼聚糖在2%鹽酸下制得的粒狀殼聚糖水凝膠裝入分離柱,用5 g/L的α-淀粉酶上柱后,為別以蒸餾水和pH為6的磷酸緩沖液為洗脫液,洗出液每2 mL一次,逐次承接,分別檢測過柱前后的酶活力,結(jié)果如表1,2所示.

表1 蒸餾水為洗脫液的酶活力數(shù)據(jù)Table 1 Purification of α-amylase with chitosan gel by eluating with water

表2 pH6.0的緩沖液為洗脫液的酶活力數(shù)據(jù)Table 2 Purification of α-amylase with chitosan gel by eluating with buffer

從表2過柱前后的比活力比較,得出α-淀粉酶經(jīng)過粒狀殼聚糖水凝膠為層析分離材料的柱分離后,仍能保持良好的酶活力.

3 結(jié) 論

本實驗考察了酸性水溶液、醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量濃度和殼聚糖脫乙酰度等因素對殼聚糖粒狀水凝膠分離牛血清蛋白分離性能的影響,得出了殼聚糖粒狀水凝膠分離牛血清蛋白具有最佳效果的性狀參數(shù):脫乙酰度為88.8%,質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的殼聚糖在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%醋酸下制得的粒狀殼聚糖水凝膠.用最佳條件下制得的殼聚糖水凝膠柱層析分離α-淀粉酶,通過考察酶過柱前后的酶活力變化,表明了殼聚糖水凝膠對蛋白質(zhì)的生物活性保持良好.將殼聚糖水凝膠作為分離介質(zhì),有較好的應(yīng)用價值.

[1] 蔣挺大.甲殼素[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001.

[2] 楊新超,趙祥穎,劉建軍.殼聚糖的性質(zhì)、生成及應(yīng)用[J].食品與藥品,2005,7(8):59-62.

[3] 唐振興,錢俊青.殼聚糖凝膠的制備及應(yīng)用研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,33(6):610-613.

[4] 唐振興,錢俊青,石陸娥.殼聚糖凝膠吸附蛋白質(zhì)機理研究[J].精細(xì)化工,2004,21(11):832-730.

[5] LOW C R.An introduction to affinity chromatography[M].Mishawaka:North-Holland Pub Co,1979.

[6] LUONG J H T.High performance liquid chromatography of biomacromolecules[J].Biotechnology and Bioengineering,1988,31(6):439-445.

[7] 唐振興,錢俊青,石陸娥.殼聚糖層析凝膠洗脫條件優(yōu)化[J].精細(xì)化工,2004,21(10):726-730.

[8] 黃麗,方波,朱葉,等.新型低密度脂蛋白吸附劑的制備及吸附性能初步研究[J].中國血液流變學(xué)雜志,2006,16(4):509-522.

[9] 陳潔,楊方琪.甲殼素脫乙酰度的測定方法[J].無錫輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,1993,12(3):255-259.

[10] 焦利敏,廖學(xué)品,石碧.紫外分光光度法下直接測定蛋白質(zhì)溶液的濃度[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2007,19(5):562-565.

[11] 榮俊,楊待建,伍曉雄.加酶飼料中淀粉酶總活力的測定-碘淀粉比色法[J].飼料工業(yè),1994,15(3):40-42.

[12] 王家東,王榮榮,侯紅萍.殼聚糖的制備及應(yīng)用進展[J].食品研究與開發(fā),2005,26(5):173-176.