低分子量肝素對博來霉素誘導的大鼠肺纖維化的干預作用

柴燕玲，杜俊毅，張 濤，牛小群，吳文娟，曹 宇

（昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，云南 昆明 650101）

肺纖維化是一種發(fā)病隱匿、進展迅速、病死率高，且治療效果欠佳的慢性肺部疾患。以肺泡間質(zhì)炎癥細胞浸潤（中性粒細胞、單核/巨噬細胞、淋巴細胞）、纖維母細胞增生和細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix,ECM）進行性沉積為主要特征。本研究利用博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化模型，觀察LMWH對大鼠肺組織中TGF-β1水平變化的影響，并與地塞米松作比較，探討LMWH對肺纖維化的保護作用。

材料和方法

一、材料和試劑 健康SPF級雄性SD大鼠100只，體重220～260g，購自昆明醫(yī)學院實驗動物中心。注射用鹽酸博來霉素粉劑（日本化藥株式會社，15mg/支，批號191130），10%水合氯醛（昆明醫(yī)學院動物中心提供），低分子量肝素鈉（昆明積大制藥有限公司，批號080501），地塞米松（山東新華制藥股份有限公司，批號0907041），大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒 （Santa Cruz），兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體（Santa Cruz），第2代通用型二步法檢測系統(tǒng)（pv-9000）（北京中杉金橋），羥脯氨酸堿水法測試盒（南京建成生物工程研究所）。

二、方法 1.模型的建立和分組：將動物隨機分配分成4組，每組25只。健康對照組，參照Szapiel等[1]的方法氣管內(nèi)注入生理鹽水代替博來霉素。肺纖維化模型組，氣管內(nèi)注入博來霉素（按5 mg/kg比例溶于0.2～0.3ml生理鹽水中）。地塞米松干預組，造模當日予以每日地塞米松腹腔注射（1 mg/kg）。LMWH干預組，造模當日起開始每天給予低分子肝素1000單位肌肉注射。各組隨機分別于造模后第1，3，7，14及28d各處死大鼠5只。

2.肺組織標本制備：各組大鼠予以10%水合氯醛（3.8ml/kg）腹腔注射麻醉，剪開腹腔，腹主動脈采血，剪開胸腔，分離氣管和肺臟，右側(cè)肺臟用手術(shù)縫合線結(jié)扎，左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)（參照史菲等[2]的方法）。BALF存于-80℃保存，供測TGF-β1用。取右肺下葉10%福爾馬林溶液內(nèi)固定后放入10%福爾馬林溶液內(nèi)固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片，行TGF-β1免疫組化檢查；右肺上葉保存于-70℃低溫冰箱，用堿水解法檢測羥脯氨酸含量。

3.TGF-β1的檢測：ELISA法檢測BALF中TGF-β1蛋白量，根據(jù)試劑盒提供的方法進行反應，終止反應后用酶聯(lián)儀測492nm光密度（OD），結(jié)果與標準曲線比較確定TGF-β1含量。

4.免疫組化檢測肺組織TGF-β1：常規(guī)脫蠟、水化、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；抗原修復；5%BSA封閉；一抗，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體1∶300（抗體為胞漿表達）；二抗，辣根酶標記羊抗兔IgG多聚體；DAB顯色；常規(guī)蘇木素復染、鹽酸酒精分化、返藍、脫水、透明、封片。免疫組化染色結(jié)果應用HP1000彩色圖文病理分析系統(tǒng)（湖北千屏影像有限公司）進行分析，將肺組織各時點切片隨機取染色區(qū)域5個高倍視野（×400），測量并記錄每個視野陽性染色的平均積分光密度（IOD）值。

5.肺組織羥脯氨酸測定（堿水法）：羥脯氨酸的測定采用南京建成生物技術(shù)公司的堿水解試劑盒，按照產(chǎn)品說明書進行操作。

6.統(tǒng)計學處理：應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)資料以表示，采用單因素方差分析方法，組間差別采用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、大鼠肺組織大體觀察 對照組大鼠肺組織呈粉紅色，表面光滑有光澤，質(zhì)地柔軟，彈性良好。模型組大鼠肺組織顏色暗紅，彈性降低，質(zhì)地較硬，肺葉腫脹，早期雙肺葉可見散在出血病灶，后期雙肺組織出現(xiàn)灰白色的小結(jié)節(jié)。2個干預組肺組織腫脹程度較模型組為輕，早期亦可見肺葉出血病灶，但后期肺組織灰白色小結(jié)節(jié)較少。

二、肺組織TGF-β1的表達 TGF-β1主要表達在胞漿，主要表達的細胞有肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞、肺成纖維細胞、支氣管粘膜上皮細胞。TGF-β1在對照組肺組織均為弱表達。模型組和干預組的TGF-β1表達較對照組有明顯增加（P＜0.05）。干預組TGF-β1表達均較模型組降低（P＜0.05），其中LMWH組第28d TGF-β1表達地塞米松組顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

三、血清及肺泡灌洗液TGF-β1含量變化 第7、14、28d模型組和干預組的血清TGF-β1含量較對照組有明顯增加（P＜0.05），干預組TGF-β1表達均較模型組降低（P＜0.05），其中LMWH組第14d TGF-β1表達較地塞米松組顯著降低（P＜0.05）。BALF的TGF-β1含量變化與血清一致。結(jié)果見表2。

四、肺組織羥脯氨酸的變化 氣管內(nèi)滴入博來霉素后，模型組肺組織羥脯氨酸含量明顯升高（P＜0.05），采用地塞米松和LMWH治療后明顯降低（P＜0.05），與模型組相比，地塞米松和LMWH均明顯降低HYP的含量（P＜0.05），且LMWH的作用較地塞米松更為顯著（第28d，P＜0.05）。如表3所示。

討 論

肺纖維化是一種以間質(zhì)纖維化及肺臟毀損為特征的疾病，是多種彌漫性肺間質(zhì)疾病的最終轉(zhuǎn)歸。其發(fā)病機制仍不十分明確，目前尚無特效藥物治療，臨床預后差。本研究采用肺纖維化的最經(jīng)典博來霉素大鼠損傷模型[3,4]，來研究LMWH對肺間質(zhì)纖維化的干預作用及相關(guān)機制。

表1 肺組織 TGF-β1 的表達 （，n=5）

表1 肺組織 TGF-β1 的表達 （，n=5）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，▲P＜0.05。

組 別1d3d7d14d 28d正常對照組26.13±3.8526.28±5.4226.72±5.0627.55±4.69 28.04±2.58模型組26.18±3.4332.41±4.2465.24±5.14*85.45±5.53* 121.06±9.56*地塞米松組26.42±3.6531.85±2.9349.44±5.10*75.56±5.50*△ 97.69±9.28*△低分子肝素組27.07±3.8532.23±3.4647.91±4.95*73.15±6.50*△ 88.92±6.13*△▲

表2 各組血清及肺泡灌洗液TGF-β1含量的比較（，pg/ml，n=5）

表2 各組血清及肺泡灌洗液TGF-β1含量的比較（，pg/ml，n=5）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，▲P＜0.05。

組 別1d 3d 7d 14d 28d血清正常對照組169.52±12.98172.21±28.83176.72±29.10185.84±15.98 198.74±14.43模型組174.87±30.48201.61±29.11357.66±36.16*410.03±45.16* 510.65±60.99*地塞米松組 181.00±20.49 182.90±43.68 256.35±50.89*△ 359.51±53.97*△ 403.64±40.57*△低分子肝素組 179.18±23.29 199.41±32.86 265.08±45.19*△ 313.41±34.42*△▲ 368.76±39.60*△BALF正常對照組 18.81±2.16 19.56±2.27 20.82±1.79 20.79±2.67 23.44±3.69模型組 18.91±1.84 28.55±5.44 48.94±4.96* 69.53±6.46* 88.00±5.39*地塞米松組 19.29±2.23 25.72±3.52 39.22±4.87*△ 58.81±8.14*△ 77.96±9.54*△低分子肝素組19.31±2.2827.01±3.4640.45±3.97*△49.16±5.86*△▲ 69.79±8.47*△

表3 各組肺組織羥脯氨酸含量的影響（，μg/mg，n=5）

表3 各組肺組織羥脯氨酸含量的影響（，μg/mg，n=5）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，▲P＜0.05。

組 別1d3d7d14d 28d正常對照組285.10±28.11291.11±27.78303.45±23.40303.66±30.59 319.20±35.59模型組289.45±25.50383.92±20.90*689.80±35.57*801.63±32.62* 888.87±32.72*地塞米松組286.00±24.65361.25±33.39*565.85±32.67*△698.02±48.92*△ 817.22±43.51*△低分子肝素組287.48±35.14363.01±30.67*572.66±25.20*△648.76±40.92*△ 758.36±44.44*△▲

肺纖維化的確切發(fā)病機制目前尚不清楚。動物實驗和臨床研究表明，細胞因子在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。此類細胞因子有轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β），血小板源性生長因子（PDGF），腫瘤壞死因子（TNF-α，β，γ），白介素（IL-1、6、8），成纖維細胞生長因子（FGF），胰島素樣生長因子（IGF），結(jié)締組織生長因子（CTGF）等[5-7]。TGF-β是致纖維化關(guān)鍵性的細胞因子，在其中起著重要的作用。TGF-β是研究最深入、作用最重要的細胞因子。TGF-β 3種異構(gòu)型（TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3）的生物學特征基本相同，其中TGF-β1與肺纖維化的關(guān)系最為密切，這在運用TGF-β1抗體減弱博來霉素誘導的肺纖維化試驗和特異性纖維性肺疾病的病人檢測到TGF-β1的合成增加的事實中得到證實[8]。TGF-β是一種生物學功能復雜的細胞因子，參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、黏附和運動及ECM的分泌，是組織生長、修復、增殖的重要因子，也是肺纖維化發(fā)生過程中最直接的細胞因子。TGF-β1是一個強大的細胞增殖調(diào)節(jié)劑，通過血小板衍生生長因子可促進肺成纖維細胞增殖。TGF-β1對于結(jié)構(gòu)細胞如成纖維細胞有很重要的直接作用，是最重要的ECM蛋白刺激因子之一，被TGF-β1激活的成纖維細胞能促進PGs在肺內(nèi)異常沉積[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化急性加重時，患者血漿D-二聚體明顯升高[10]。由于D-二聚體是血管內(nèi)凝血的標志，因此認為肺纖維患者凝血機制激活?？梢?肺組織微血管內(nèi)外微環(huán)境促凝和抗纖溶活性升高是肺纖維化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一。有研究表明,肺纖維化的發(fā)病機制與肺內(nèi)微環(huán)境凝血機制異常有關(guān)。Kubo H等[10]對5家醫(yī)院的56例患者進行了前瞻性抗凝治療研究，該試驗顯示抗凝治療可以延長肺纖維化患者中位生存天數(shù),改善患者預后。但對于抗凝治療改善預后的具體機制尚不清楚。

目前，對抗凝治療肺纖維化取得療效的確切機制尚不清楚，可能與其對血管內(nèi)外微環(huán)境的抗凝作用有關(guān)?？鼓委熆蓽p少細胞外纖維素沉積，提高ECM降解，促進肺泡上皮細胞正常修復，凝血級聯(lián)反應抑制可減少與纖維化發(fā)生有關(guān)的產(chǎn)物及因子生成。并且，低分子肝素可下調(diào)參與肺纖維維化的TGF-β1，內(nèi)皮素1（ET-1），纖維母細胞生長因子1（FGF-1）的表達[11]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，LMWH對博來霉素誘發(fā)的大鼠肺間質(zhì)纖維化具有保護作用。其可能是通過下調(diào)TGF-β1的表達而實現(xiàn)的，其具體作用機制有待于進一步深入研究。

[1]SZAPIELSV,ELSON NA,FULMER JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J].AmRevRespir Dis,1979,120:893-899.

[2]史菲,邱晨.大鼠支氣管灌洗術(shù)標準化操作的探討[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2002,12(24):67-69.

[3]MOELLER A,RODRIGUEZ-LECOMPTE JC,WANGL,et al.Models of pulmonary fibtosis[J].Drug Discovery Today,2006,3(3):243-250.

[4]THRALL RS,MCCORMICK JR,JACK RM,et al.Bleomycininduced pulmonary fibrosis in the rat[J].Am J Pathol,1979,95(1):117-130.

[5]ASK K,BONNIAUD P,MAASS K,et al.Progressive pulmonary fibrosis is mediated by TGF-beta isoform 1 but not TGF-brta3[J].Int J Biochem Cell Biol,2008,40(3):484-495.

[6]CAO B,GUO Z,ZHU Y,et al.The potential role of PDGF,IGF-1,TGF-beta expression in idiopathic pul monary fibrosis[J].Chin Med J(Engl),2000,113(9):776-782.

[7]KANGHR,CHOSJ,LEE CG,et al.Transforminggrowth factor(TGF)-beta1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent,bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12[J].J Biol Chem,2007,282(10):7723-7732.

[8]WALKER TR,MOORE SM,MARK F,et al.Platelet-gerived growth factor-BB and thrombin active phosphoinositide 3-kinase and protein kinase B:role in mediating airway smooth muscle proliferation[J].Mol Pharmacol,1998,54:1007-1015.

[9]VENKATESAN N,ROUGHLEY PJ,LUDWIG MS.Proteoglycan expression in bleomycin lung fibroblasts:role of transforming growth factor-β1 and interferon-γ[J].Am J Physiol LungCell Mol Physiol,2002,283(4):806-814.

[10]KUBO H,NAKAYAMA K,YANAI M,et al.Anticoagulant therapy for idiopathic pulmonary fibrosis[J].Chest,2005,128(3):1475-1482.

[11]LI CM,KHOSLA J,HOYLE P,et al.Transforming growth factor-β1 modifies fibroblast growth factor-2 production in type II cells[J].Chest,2001,120(1):60-61.