顯微鏡檢測用蔗糖和蔗糖產(chǎn)品摻假的蜂蜜

黃文誠 譯自Apidologie（1995）26,131-139

蜂蜜摻假是盡人皆知的問題，已有許多分析方法檢測用各種糖和廉價(jià)糖漿偽造的蜂蜜。在某些熱帶國家，當(dāng)?shù)厥袌龀鍪鄣姆涿劭赡苤苯犹砑诱崽?、蔗糖漿、加熱酸水解蔗糖得到的蔗糖漿或者給蜜蜂喂糖獲得的“蜜”。通過常規(guī)的化學(xué)分析，諸如果糖、葡萄糖、蔗糖、羥甲基糠醛含量及淀粉酶值，這樣蜂蜜的摻假容易被檢測出。

然而，在許多發(fā)展中國家，不一定有上述常規(guī)分析實(shí)驗(yàn)室，借助簡單的顯微鏡分析可能檢測用蔗糖及蔗糖產(chǎn)品的摻假蜂蜜。蔗糖有內(nèi)在來源的指示物。它含有來源于甘蔗莖的許多有特性的顆粒：薄壁細(xì)胞、硬化細(xì)胞、表皮細(xì)胞、環(huán)形導(dǎo)管的單環(huán)及甘蔗淀粉。這些顆粒存在于原糖、精制白糖和紅糖（B型）以及糖蜜，但是不含在甜菜糖、槭糖和印度尼西亞棕櫚糖中。

文獻(xiàn)中沒有介紹過蜂蜜中蔗糖顆粒顯微鏡分析的具體方法。有些研究人員提到蜂蜜沉淀中除花粉以外還存在其他結(jié)構(gòu)的顆粒，但是沒有給出植物細(xì)胞的詳細(xì)識別方法。

在蔗糖及蔗糖產(chǎn)品用于摻假的事例中，如同經(jīng)典的花粉分析，離心1∶2蜂蜜水溶液，得到的殘?jiān)谐嘶ǚ邸⒏事冻煞趾筒菟峤Y(jié)晶以外，含有表示特性的甘蔗植物細(xì)胞。將水洗的殘?jiān)惭b在甘油漿中以后，進(jìn)行顯微鏡分析。采用交叉偏振和1級紅色阻滯片，蔗糖的存在立刻顯示出蔗糖細(xì)胞的明亮的圖像。圖1～7是典型的形式。乙酸水解法是孢粉分析的程序，花粉沉淀通過無水乙酸或硫酸的乙酸水解以獲得清晰的花粉細(xì)胞壁，此法不能用于檢查這些植物細(xì)胞，因?yàn)樵谝宜崴膺^程中這些細(xì)胞被破壞了。

圖1 蜂蜜中蔗糖的硬化細(xì)胞，正常光，750×

圖2 蜂蜜中蔗糖的硬化細(xì)胞，交叉棱鏡，750×

圖3 蜂蜜中蔗糖的薄壁細(xì)胞，交叉棱鏡，750×

圖4 蜂蜜中蔗糖的單環(huán)，正常光，750×

圖5 蜂蜜中蔗糖的單環(huán)，交叉棱鏡，750×

圖6 蜂蜜中蔗糖的表皮細(xì)胞，正常光，750×

圖7 蜂蜜中蔗糖的表皮細(xì)胞，交叉棱鏡，750×

偏光顯微鏡對于這種分析尤其有用，因?yàn)榻徊胬忡R在黑色背景下具有由許多纖維素組成的細(xì)胞壁的植物細(xì)胞顯示1級白干擾色；許多晶體和固有的淀粉顆粒也可看出。然而，花粉、酵母和真菌孢子光學(xué)上是不活躍的，在交叉棱鏡下不能被看出。插入1級紅色阻滯片，黑色背景變成酒紅色，花粉、酵母和真菌孢子能被辨別，但是不被照亮。然而，取決于它們在顯微鏡視野的方向，光學(xué)活性的植物細(xì)胞（和晶體及固有的淀粉）顯示2級亮藍(lán)色（紅色I(xiàn)加白色I(xiàn)）或1級黃干擾色（紅色I(xiàn)減白色I(xiàn)）。

本研究中，對蔗糖組織的顯微鏡分析結(jié)果與蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖含量以及羥甲基糠醛值進(jìn)行了比較。在某些熱帶（亞熱帶）國家，蜜蜂從切割的或燃燒的甘蔗莖采集滲出液。因此，在這項(xiàng)研究中也包括一些蔗糖蜜的顯微鏡分析。

1 材料和方法

1.1 樣本

蜂蜜樣本是1987年進(jìn)行調(diào)查時(shí)從菲律賓得到的。兩個(gè)高度懷疑的樣本是從地方市場購買的，在荷蘭食品檢驗(yàn)局分析。另外8個(gè)蜂蜜樣本來自尼泊爾加德滿都，它們是在BETRESP實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行化學(xué)和顯微鏡分析時(shí)遇到的。通過對300多個(gè)蜂蜜樣本的分析，BETRESP為尼泊爾建立蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。由于一些樣本含有植物組織，也在荷蘭阿姆斯特丹食品健康保護(hù)檢驗(yàn)局實(shí)驗(yàn)室分析它們。

蔗糖樣本是在尼泊爾加德滿都商店購買的。純蔗糖蜜是從荷蘭阿姆斯特丹食品檢驗(yàn)局得到的。1個(gè)樣本來自古巴，另一個(gè)來自馬德拉（群島）。

1.2 分析方法

顯微鏡分析是按照蜜源植物國際委員會發(fā)布的方法進(jìn)行，在20 ml水中溶解10 g蜂蜜（或10 g蔗糖），離心，用水洗出沉淀，再次離心，取沉淀放入100 μl水中。為進(jìn)行定量分析，取10 μl懸液放在載玻片的1cm2上，干燥，覆蓋甘油膠。蔗糖顆粒用交叉偏振和1級紅色阻滯片在400倍下計(jì)數(shù)。其余懸液放在另一載玻片，干燥，覆蓋甘油膠。這個(gè)玻片用于定性鑒定，必要時(shí)用同樣的顯微鏡技術(shù)進(jìn)行低數(shù)量計(jì)數(shù)。

蔗糖的薄壁細(xì)胞近似長方形，有各種大?。杭?xì)胞大部分長為50～100um,寬約40～60um。也有近圓形的。硬化細(xì)胞長方形，長約100～200um，寬40～50um。這兩種細(xì)胞都有光學(xué)激活的細(xì)胞壁藍(lán)色（北方或西南方向）和黃色（西北方或東南方向）的偏光色。薄壁細(xì)胞和硬化細(xì)胞的表面具有許多直徑2～3um的小坑，每個(gè)小坑有1個(gè)偏振交叉或具光學(xué)激活的外界（黃色或藍(lán)色）的單一射線（圖1～3）。

因?yàn)樗鼈冇凶约旱男】訛樘匦裕”诩?xì)胞和硬化細(xì)胞在定量工作中一起計(jì)數(shù)，表示為10 g蜂蜜中它們的總數(shù)。細(xì)胞的聚集部分在每次計(jì)數(shù)時(shí)作為1個(gè)細(xì)胞。環(huán)形導(dǎo)管的單環(huán)細(xì)胞也有特性。它們的直徑約30～50um（圖4）。在每個(gè)單環(huán)顯示藍(lán)色和黃色偏振光色；顏色被小的紅色帶（圖5：黑色）交替改變。單環(huán)的計(jì)數(shù)表示為10g蜂蜜中的總數(shù)。

表皮細(xì)胞的特點(diǎn)是它們的起伏的長細(xì)胞壁；1個(gè)細(xì)胞的大小約15um×150um。長的細(xì)胞壁在東北或西南方向顯示亮藍(lán)的偏振光色。藍(lán)色細(xì)胞壁之間是明亮的黃色。在另一方向（西北或東南）偏振光色相反（圖6和7）。表皮細(xì)胞在蜂蜜殘留中大部分聚集在一起。計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞和聚集細(xì)胞，表示為10g蜂蜜中的總數(shù)。

用高壓液相色譜技術(shù)確定羥甲基糠醛；糖（葡萄糖、果糖和蔗糖含量）也用一種高壓液相色譜方法測定。pH和電導(dǎo)率以20%蜂蜜（m/m）（或蔗糖溶于蒸餾水）測量。電導(dǎo)率在蜂蜜表示為uS/cm。水含量用折射計(jì)測量。

2 結(jié)果

來自菲律賓和尼泊爾的10個(gè)摻假蜂蜜樣本化學(xué)的和顯微鏡的分析結(jié)果見表1和表2。表中也給出了1種結(jié)晶的正常質(zhì)量的尼泊爾蔗糖以及2種低質(zhì)量的蔗糖糖蜜細(xì)粉的分析結(jié)果。

蔗糖蜂蜜樣本為暗棕色或黑色，有蔗糖的回味，其顯微鏡分析未觀察到蔗糖植物細(xì)胞。在R128樣本中的花粉?？倲?shù)具有正常值；大部分花粉來自棕櫚（Palmeae species）。樣本A485不含花粉，但是有大量的草酸鈣結(jié)晶。

表1 蜂蜜和蔗糖樣本的化學(xué)性質(zhì)

3 討論

3.1 蜂蜜樣本

10個(gè)蜂蜜樣本的化學(xué)數(shù)據(jù)證明它們?nèi)炕虿糠謸郊倭?，或至少過度加熱了。顯微鏡數(shù)據(jù)得出的結(jié)論是樣本摻假了。蔗糖組織與蔗糖含量沒有直接的相互關(guān)系，但是8個(gè)尼泊爾樣本的確有大量的蔗糖組織和大量的羥甲基糠醛，它是用酸水解蔗糖漿摻假的指示。2個(gè)菲律賓蜂蜜不包括在內(nèi)，實(shí)際上它們不含羥甲基糠醛（它們含有非常低的淀粉酶值，未插在表內(nèi)），或許用蔗糖直接與蜂蜜混合摻假。

在某些蜂蜜樣本中與蔗糖組織一道有許多小麥淀粉顆粒，可以指出它們用少量的蔗糖糖蜜摻假了。

表2 蜂蜜和蔗糖樣本的顯微鏡特征

3.2 顯微鏡分析

采用偏光顯微鏡（交叉棱鏡和1級紅色阻滯片）使蔗糖組織的鑒定非常容易。使用偏光顯微鏡放大100倍就能鑒別薄壁細(xì)胞、硬化細(xì)胞、單環(huán)和表皮細(xì)胞。尤其，第一眼就能看到環(huán)。為了正確識別表皮細(xì)胞，特別是薄壁細(xì)胞和硬化細(xì)胞最好采用較大倍率（400倍），或者只用交叉棱鏡，這樣容易檢查出薄壁細(xì)胞有特征的小坑。

這10個(gè)摻假蜂蜜樣本的薄壁細(xì)胞和硬化細(xì)胞平均值及標(biāo)準(zhǔn)差和范圍制成表3。

尼泊爾典型的白糖10g樣本含有的薄壁細(xì)胞和硬化細(xì)胞數(shù)為5902。在以前的研究，發(fā)現(xiàn)來自不同國家的各種蔗糖，10g中含有單環(huán)76～595個(gè)；表皮細(xì)胞25～222個(gè)；薄壁細(xì)胞和硬化細(xì)胞的數(shù)值特別大，通常為3000～6000個(gè)。也發(fā)現(xiàn)蔗糖含有薄壁細(xì)胞、硬化細(xì)胞、表皮細(xì)胞和環(huán)。從這些觀察表明，在鑒別蜂蜜樣本的蔗糖組織時(shí)，似乎絕不可能得到假陰性的結(jié)果。

不可能有假陽性結(jié)果。從在尼泊爾BETRESP工程監(jiān)督之下的養(yǎng)蜂人得到的蜂蜜樣本，經(jīng)顯微鏡分析沒發(fā)現(xiàn)蔗糖組織；化學(xué)分析也顯示正常值。

估計(jì)蜂蜜中存在蔗糖的檢測限度為，樣本顯示在載玻片1cm2面積上，10g蜂蜜中最低約有30個(gè)薄壁細(xì)胞能容易被檢查出來。從這些數(shù)據(jù)和計(jì)算蔗糖中薄壁細(xì)胞和硬化細(xì)胞數(shù)量的自然變量，由此得出的結(jié)論是，在樣本中甚至含有1%或2%蔗糖用這種方法就能檢查出來。

表3 10個(gè)摻假蜂蜜樣本中薄壁細(xì)胞、硬化細(xì)胞、環(huán)合表皮細(xì)胞的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差以及范圍

4 結(jié)論

蜂蜜樣本甘蔗組織的顯微鏡篩查，對檢測甚至添加到蜂蜜里非常低的蔗糖、轉(zhuǎn)化糖漿及喂蜜蜂蔗糖產(chǎn)的“蜜”是一種附加方法。本研究中描述的，當(dāng)檢查蔗糖蜜樣本不含甘蔗植物細(xì)胞時(shí)，我們可以得出結(jié)論：甘蔗組織的存在表明蜂蜜樣本摻假了。計(jì)算甘蔗組織，能得到蜂蜜樣本中蔗糖數(shù)量的指示。這種方法容易應(yīng)用在來自發(fā)展中國家的蜂蜜分析，用簡單的設(shè)備可以做到。與羥甲基糠醛值相結(jié)合，顯微鏡方法可以區(qū)分加熱和摻假。