三種栽培紅豆杉的生藥學(xué)研究

符德歡，李學(xué)芳，趙彩肖，張曉南，趙庭周，蔣博謀

(1．云南省藥物研究所，云南 昆明 650111;2．桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 5410003．云南白藥武定基地，云南 武定 651600;4．貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

云南紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物云南紅豆杉Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu的干燥枝葉。別名土榧子，其枝、葉清熱解毒，涼血，驅(qū)蛔蟲，消食[1，2]。含多種紫杉烷型二萜化合物及其生物堿，其藥用有效成分紫杉醇對(duì)人體癌Hela細(xì)胞有顯著抑制作用[3]。其枝葉含巴馬亭Ⅲ、三尖杉寧堿、云南紅豆杉酯甲、乙等[4]。南方紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物南方紅豆杉Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.mairei(Lemée et lévl.)Cheng et L.K.Fu的干燥枝葉。別名美麗紅豆杉，其葉用于咽喉痛[1，2]。其含紅豆杉總多糖[5]。曼地亞紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物曼地亞紅豆杉Taxus media Rehd.cv.Hicksii的干燥枝葉。又名雜種紅豆杉，為天然雜交種，母本為Taxus cuspidata，父本為Taxus baccata。其4～5年生植物的葉和樹枝中紫杉醇含量與70～80年天然短葉紅豆杉樹皮含量相當(dāng)[2]。其含3種雙黃酮、葉的乙醇提取物中分離純化得到二萜類化合物、黃酮類化合物[6，7]。人工栽培紅豆杉一方面可解決紫杉醇來源的短缺問題，另一方面又是紅豆杉物種保護(hù)的良好措施，使紅豆杉的種質(zhì)資源得到較好的延續(xù)。為此，本文對(duì)以上3種人工栽培紅豆杉進(jìn)行了原植物檢索，藥材性狀檢索，顯微鑒定，及薄層色譜[8]等方面的生藥學(xué)研究，為其藥材 (枝葉)的鑒別及其進(jìn)一步深入研究提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料均采自云南武定，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所分類室陶德定副研究員鑒定為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬植物云南紅豆杉Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu，南方紅豆杉 Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.mairei(Lemée et lévl.)Cheng et L.K.Fu，曼地亞紅豆杉 Taxus media Rehd.cv.Hicksii。

1.2 試劑

乙醇 (化學(xué)純)，冰醋酸，甘油，甲醇，TO型生物透明劑，0.1%固綠，0.5%番紅，石蠟，F(xiàn)AA固定液，氨試液，三氯甲烷，丁醇，冰醋酸，中性樹膠，濃硫酸，氯仿。

1.3 儀器

FA2004N電子分析天平，BM－Ⅵ生物組織冷凍包埋機(jī)，CS－Ⅳ型攤片烤片機(jī)，QP－Ⅲ生物組織切片機(jī)，TS－12H+生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，MicrE400 Nikon顯微鏡，數(shù)碼顯微照相機(jī)，SMZ1000體視鏡，GZX－9030 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，101A－2E電熱鼓風(fēng)干燥箱，生物組織攤片烤片機(jī) (CS－IV型)，生物組織刀刃磨機(jī) (MD－II型)，超聲波清洗器 (SK3200LHC)、ZF－Ⅱ型3用紫外分析儀，TDA溫度控制儀等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原植物及藥材性狀檢索

2.2 顯微鑒定

制作莖、葉橫切面片，粉末片等進(jìn)行觀察比較、分析描述。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 原植物檢索

植物檢索表[9，10]

1.葉較疏，排成羽狀2列，平展。

2.葉質(zhì)地較薄，邊緣向下反曲或微反曲，葉上部漸窄，基部偏斜成彎鐮狀，披針狀條形至條狀披針形，干后通常色澤變深 …………………1.云南紅豆杉T.yunnanensis

2.葉質(zhì)地較厚，邊緣不反曲或微反曲，葉較寬長(zhǎng)，常呈彎鐮狀，長(zhǎng)2～3.5cm，寬3～4.5mm，上部漸窄或微漸窄，先端通常漸尖，中脈帶色澤與氣孔帶不同，上無(wú)角質(zhì)乳頭狀突起，或與氣孔帶相鄰的中脈帶兩邊有一至數(shù)條或成片狀分布的角質(zhì)乳頭狀突起點(diǎn);種子多呈倒卵圓形………………………………2.南方紅豆杉T.chinensis

1.葉較密，螺旋狀著生，基部扭轉(zhuǎn)排成二列，斜展。

3.葉質(zhì)地厚，邊緣微反卷，條形，微彎;長(zhǎng)1.2～3cm，寬2～4mm，先端漸尖或微急尖，下面沿中脈的兩側(cè)有兩條寬灰綠色或黃綠色氣孔帶，中脈帶上有密生的均勻微小乳頭點(diǎn);種子扁卵圓形 ……3.曼地亞紅豆杉T.media

3.2 藥材性狀檢索

性狀檢索表

1.枝外皮粗糙，灰褐色或紫褐色，斷面黃白色。氣微，味苦。

2.質(zhì)脆，易折斷。葉披針狀條形至條狀披針形，邊緣微反曲，有刺狀小尖頭;中脈及兩側(cè)氣孔帶均密生角質(zhì)化乳頭狀突起…………………………………1.云南紅豆杉

2.質(zhì)硬，不易折斷。葉較寬長(zhǎng)，邊緣不反曲，先端漸尖，下面中脈帶上無(wú)角質(zhì)乳頭狀突起………2.南方紅豆杉

1.枝外皮粗糙，灰褐色，斷面白色。氣特異，味苦。

3.質(zhì)硬，不易折斷。葉條形，先端漸尖，有小尖頭，邊緣微反卷;中脈兩面均凸起，下面葉脈有小乳頭狀突起…………………………………………3.曼地亞紅豆杉

3.3 顯微鑒別

3.3.1 枝橫切面特征

云南紅豆杉:整個(gè)橫切呈類圓形，表皮細(xì)胞1列，細(xì)胞類圓形，微波狀排列，外被角質(zhì)層。皮層薄壁細(xì)胞3～5列，排列疏松。韌皮部細(xì)胞扁平，排列疏松，有少數(shù)石細(xì)胞散在;木質(zhì)部較寬，約占整個(gè)橫切面的3/4，導(dǎo)管放射狀排列，木射線細(xì)胞多為1列，有的細(xì)胞中含紅棕色物。髓部薄壁細(xì)胞大，易碎 (見圖1)。

南方紅豆杉與云南紅豆杉的主要區(qū)別:表皮細(xì)胞排列較整齊。韌皮部較云南紅豆杉稍寬。石細(xì)胞稍多，散在或成群。木射線細(xì)胞中無(wú)紅棕色物(見圖2)。

曼地亞紅豆杉與云南紅豆杉的主要區(qū)別:表皮細(xì)胞排列整齊;韌皮部中石細(xì)胞偶見 (見圖3)。

圖1 云南紅豆杉枝橫切面圖

3.3.2 葉橫切面特征

云南紅豆杉:上、下表皮細(xì)胞各1列，卵圓形或不規(guī)則圓形，排列較整齊;外被較厚角質(zhì)層。柵欄組織細(xì)胞1～2列，過中脈。海綿組織細(xì)胞排列疏松。中脈較平直，維管束外韌型，木質(zhì)部管胞散列。維管束周圍的薄壁細(xì)胞中含紅棕色物。薄壁細(xì)胞中含較多草酸鈣砂晶及色素物 (見圖4)。

圖4 云南紅豆杉葉橫切面圖

南方紅豆杉與云南紅豆杉的主要區(qū)別:上、下表皮細(xì)胞大小相近，微波狀排列;中脈向上突出，維管束周圍的薄壁細(xì)胞中無(wú)紅棕色物 (見圖5)。

圖5 南方紅豆杉葉橫切面圖

曼地亞紅豆杉與云南紅豆杉的主要區(qū)別:上、下表皮細(xì)胞類方形;中脈微向下突出，維管束類圓形。薄壁細(xì)胞中紅棕色物及草酸鈣砂晶稀少 (見圖6)。

圖6 曼地亞紅豆杉葉橫切面圖

3.3.3 粉末特征

云南紅豆杉粉末:①葉下表皮細(xì)胞表面觀類多角形，壁略厚，氣孔較多，凹陷，保衛(wèi)細(xì)胞較大，呈啞鈴型。②草酸鈣砂晶存在薄壁細(xì)胞中或鑲嵌于纖維上，顆粒狀。③上表皮細(xì)胞表面觀類多角形，垂周壁平直，無(wú)氣孔。④ 石細(xì)胞少見，類三角形，壁較厚，胞腔小。⑤ 樹脂道較多，紅棕色，形狀大小不一。⑥管胞螺紋狀，直徑12～18μm。⑦纖維成束或單個(gè)散在，長(zhǎng)梭形，壁厚，具斜點(diǎn)狀紋孔 (圖7)。

圖7 云南紅豆杉葉橫切面圖

南方紅豆杉與云南紅豆杉的主要區(qū)別:石細(xì)胞較多，散在或成群，壁稍厚，胞腔稍大。樹脂道及草酸鈣砂晶較云南紅豆杉少 (圖8)。

曼地亞紅豆杉與云南紅豆杉的主要區(qū)別:石細(xì)胞偶見，較小，類長(zhǎng)方形或類圓形，壁稍厚，胞腔小。草酸鈣砂晶及樹脂道均較少 (圖9)。

3.4 薄層色譜

3.4.1 供試品液的制備

取云南紅豆杉、南方紅豆杉、曼地亞紅豆杉3種藥材粗粉各4.0g左右，分別加入95%的乙醇50mL回流2h，過濾，取濾液放入蒸發(fā)皿置水浴上(溫度62℃)濃縮成膏狀，然后分別加入10mL蒸餾水溶解，移入分液漏斗中，分別加入10mL氯仿萃取2次，取下層液濃縮至5mL作為供試品。對(duì)照品為紫杉醇批號(hào)100382－200301(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

3.4.2 展開條件

按照薄層色譜法試驗(yàn)用毛細(xì)管吸取供試品各10ul分別點(diǎn)于同一硅膠G層析板上，以甲醇∶三氯甲烷4.5∶95為開劑，展開約10cm，取出涼干，噴以5%的硫酸乙醇。105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，3種藥材供試品與對(duì)照品在同一硅膠G板相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖 (10)。

圖10 薄層色譜圖

4 小結(jié)與討論

在原植物形態(tài)鑒別中參考有關(guān)資料列出三者的原植物檢索表。藥材 (枝葉)性狀上云南紅豆杉質(zhì)脆，易折斷。斷面黃白色。氣微，味苦。中脈及兩側(cè)氣孔帶均密生角質(zhì)化乳頭狀突起。而南方紅豆杉質(zhì)硬，不易折斷。下面中脈帶上無(wú)角質(zhì)乳頭狀突起。曼地亞紅豆杉質(zhì)硬，不易折斷，斷面白色。氣特異，味苦。中脈兩面均凸起，下面葉脈有小乳頭狀突起。

枝橫切面特征:云南紅豆杉韌皮部細(xì)胞扁平，排列疏松，有少數(shù)石細(xì)胞散在。南方紅豆杉韌皮部細(xì)胞較小，排列緊密，石細(xì)胞稍多。曼地亞紅豆杉韌皮部排列較緊密，石細(xì)胞偶見。

葉橫切面特征:云南紅豆杉中脈較平直，薄壁細(xì)胞中含較多草酸鈣砂晶及色素物。南方紅豆杉中脈向上突出，薄壁細(xì)胞中含草酸鈣砂晶及紅棕色物。曼地亞紅豆杉中脈微向下突出，薄壁細(xì)胞中紅棕色物及草酸鈣砂晶稀少。

粉末特征:云南紅豆杉粉末石細(xì)胞少見，胞腔小，樹脂道較多。南方紅豆杉石細(xì)胞多，壁厚，胞腔稍大，樹脂道多。曼地亞紅豆杉石細(xì)胞較少且細(xì)小，胞腔明顯，樹脂道較稀少。

薄層色譜圖中，3種藥材與對(duì)照品在同一硅膠G板相應(yīng)位置上顯示了顏色較弱的斑點(diǎn)，可能與其藥材提取量、提取方法及紫杉醇含量等有關(guān)，還有待進(jìn)一步深入研究。

通過對(duì)3種栽培紅豆杉系統(tǒng)的生藥學(xué)研究，在原植物形態(tài)、藥材 (枝葉)性狀及顯微特征中均有一定的差異，將為這3種紅豆杉藥材 (枝葉)的鑒別及進(jìn)一步研究提供資料。

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