力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)期大鼠紋狀體5-HT、DA及其代謝物濃度的動(dòng)態(tài)變化研究＊

楊東升,劉曉莉,喬德才△

(1.北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院,北京 100875;2.浙江工業(yè)大學(xué)體育科學(xué)研究所,杭州 310014)

紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)中接受傳入信息的主要部位,參與隨意運(yùn)動(dòng)的程序編制與執(zhí)行[1]。本實(shí)驗(yàn)室前期電生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)疲勞后大鼠紋狀體神經(jīng)元高頻放電比例增高、爆發(fā)式放電活動(dòng)增多,神經(jīng)元活動(dòng)規(guī)律性減弱,初步證實(shí)了紋狀體是引起運(yùn)動(dòng)疲勞的重要中樞腦區(qū)之一[1,2]。神經(jīng)元的電活動(dòng)變化與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān),5-羥色胺(serotonin,5-HT)是腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì),多巴胺(dopamine,DA)是腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì),有研究表明,腦內(nèi)5-HT和DA代謝變化可能與運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞有關(guān)[3]。然而,以往的研究多采用斷頭取腦及定點(diǎn)采樣的方法,獲得的結(jié)果難以反映運(yùn)動(dòng)過程中中樞腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化特征。為此,本實(shí)驗(yàn)采用活體微透析結(jié)合毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)檢測(cè)技術(shù),連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察大鼠在一次性力竭運(yùn)動(dòng)過程及運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期紋狀體細(xì)胞外液中5-HT和DA及其代謝產(chǎn)物色氨酸(tryptophan,Trp)、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)含量的變化,探討一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠紋狀體主要單氨類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的影響,進(jìn)一步解釋運(yùn)動(dòng)疲勞引起紋狀體神經(jīng)元電活動(dòng)改變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

實(shí)驗(yàn)采用健康雄性Wistar大鼠6只,鼠齡8周,體重(250±10)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006-0008。常規(guī)分籠飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食,自然光照,動(dòng)物房內(nèi)溫度20℃±1℃,相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2 儀器與試劑

主要儀器:微量注射泵(BAS,MD-0250)、微透析探針(BAS,MD-2204)、微透析探針套管(BAS,MD-2251)、三維立體定位儀(日本成茂,SN-3N)、毛細(xì)管電泳儀(BECK MAN,P/ACETM MDQ)、488 nm氬離子激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIF)、Karat系統(tǒng)軟件;毛細(xì)管柱:未涂層石英毛細(xì)管柱 75μmID×50/57 cm(分離長度/總長)(BECK MAN);pH計(jì)(HANNA,HI98128)。

主要試劑:Trp,DA,Tyr,5-HIAA和5-HT標(biāo)準(zhǔn)品均購自 Sigma公司;NaCI、KCI、硼砂(分析純)等試劑購自北京芮得生物科技有限公司。人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid,aCSF)各組份濃度(mmol/L)分別為:NaCl 126,KCl 2.4,KH2PO40.5,MgCl20.85,NaHCO327.5,Na2SO40.5,CaCl21.1,pH值為7.4。無菌過濾器(0.2μm)過濾,冷藏備用。

1.3 微透析探針導(dǎo)軌的植入

大鼠以戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉,俯臥固定于腦立體定位儀上,沿大鼠頭頂正中線做矢狀切口,暴露前、后囟及冠、矢狀縫等骨性標(biāo)志。調(diào)整門齒高度,使前囟和后囟處在同一水平面上,依照大鼠腦立體定位圖譜,在紋狀體對(duì)應(yīng)的顱骨部位鉆孔,掀去硬腦膜。將透析套管定植入左側(cè)紋狀體(P∶0.2,L∶3,H∶3.2),并用小螺釘及牙科水泥固定,保證導(dǎo)軌不隨動(dòng)物的正?；顒?dòng)而移動(dòng)或松動(dòng)。術(shù)后4～5 d,手術(shù)引起的不良反應(yīng)即可消失,大鼠飲食和行為恢復(fù)正常,開始恢復(fù)性的漸增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

1.4 力竭運(yùn)動(dòng)方案

待大鼠能夠以20m/min的速度跑30min,并未見不良反應(yīng),次日即進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。一次性力竭運(yùn)動(dòng)采用本實(shí)驗(yàn)室建立的遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案[4],跑臺(tái)坡度為0°,負(fù)荷分為3級(jí):I級(jí),8.2 m/min,15 min;II級(jí) ,15 m/min,15 min;III級(jí) ,20m/min,運(yùn)動(dòng)至力竭。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)為:動(dòng)物不能維持預(yù)定跑速,滯留于跑道后擋板不動(dòng),使用光、電、聲刺激驅(qū)趕仍無效,并伴有呼吸急促,腹臥跑臺(tái),垂頭不起等行為表現(xiàn)。

由于不同大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間個(gè)體差異較大,為了便于觀察運(yùn)動(dòng)疲勞形成、發(fā)展及恢復(fù)過程中大鼠紋狀體細(xì)胞外液中神經(jīng)遞質(zhì)的變化情況,我們將力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程劃分為四個(gè)階段:運(yùn)動(dòng)前安靜期(0～30min);運(yùn)動(dòng) Ⅰ(30～60min);運(yùn)動(dòng) Ⅱ(力竭前60min～力竭)和恢復(fù)期(恢復(fù)0～90min)。

1.5 微透析-毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)

開啟透析灌流系統(tǒng),調(diào)節(jié)恒流泵控制液體流速為2μl/min,將透析探針插入預(yù)先植入腦內(nèi)的探針導(dǎo)軌,探針與人工腦脊液灌流系統(tǒng)直接相接(圖1)。灌流平衡60min后開始收集透析液,采樣頻率為15 min,每次采集樣品量30μL,連續(xù)采集大鼠安靜、運(yùn)動(dòng)、力竭和恢復(fù)過程中紋狀體的透析液,并放置-20℃的冰箱中保存待測(cè)。

取5μL透析液樣品,分別加入10μl硼砂緩沖溶液(2 mmol/L,pH 10.00),5μl異硫氰酸熒光素(0.005 mmol/L)溶液,室溫避光條件下衍生17 h,再用2 mmol/L硼砂緩沖溶液定容至100μl,進(jìn)行毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)。電泳條件:運(yùn)行電壓25 kV,實(shí)驗(yàn)溫度25℃,壓力進(jìn)樣0.5 psi,進(jìn)樣時(shí)間15 s,檢測(cè)波長220nm。

Fig.1 Schematic illustration of microdialysate and capillary electrophoresis in rat striatum during experiment

1.6 腦組織學(xué)鑒定

微透析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用10%水合氯醛按0.35 ml/kg的劑量腹腔麻醉大鼠,仰臥位固定四肢。打開大鼠胸腔,用4%福爾馬林溶液經(jīng)心臟常規(guī)灌流固定,取出腦組織,冠狀面做切片,對(duì)照大鼠腦立體定位圖譜鑒定探針尖端所在位置(圖2),探針未能準(zhǔn)確插入紋狀體的數(shù)據(jù)將被刪除。

Fig.2 Schematic illustration of the implantation of microdialysis probe

1.7 數(shù)據(jù)處理

以每只大鼠安靜透析液物質(zhì)的平均濃度為基礎(chǔ)值,將不同時(shí)間段透析液樣品中物質(zhì)濃度所占基礎(chǔ)值的百分比反映其變化規(guī)律,所有結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Repeated measures ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 力竭運(yùn)動(dòng)過程及恢復(fù)期大鼠紋狀體細(xì)胞外液中5-HT、Trp和5-HIAA水平的動(dòng)態(tài)變化

力竭運(yùn)動(dòng)過程及恢復(fù)期大鼠紋狀體細(xì)胞外液中5-HT、Trp和5-HIAA水平的變化見圖3。從圖中可見,運(yùn)動(dòng)開始30min(運(yùn)動(dòng)Ⅰ)5-HT、Trp和5-HIAA水平均未見顯著變化;從力竭前45 min(運(yùn)動(dòng)Ⅱ)三指標(biāo)開始明顯增高,與運(yùn)動(dòng)前安靜時(shí)相比5-HT約增長了1倍,Trp約增長了0.2倍,而5-HIAA增高了約2.2倍;隨后三指標(biāo)繼續(xù)增長,力竭時(shí)其含量顯著高于安靜水平(P<0.05),且在恢復(fù)期90min內(nèi)繼續(xù)保持增長趨勢(shì)(P<0.05,P<0.01)。

Fig.3 Variation of 5-HT,Trp and 5-HIAA in rats striatum during exhaustive exercise(n=6)

2.2 力竭運(yùn)動(dòng)過程及恢復(fù)期大鼠紋狀體細(xì)胞外液中DA和Tyr水平的動(dòng)態(tài)變化

力竭運(yùn)動(dòng)過程及恢復(fù)期大鼠紋狀體細(xì)胞外液中DA和Tyr水平的變化見圖4。在運(yùn)動(dòng)的第一階段(運(yùn)動(dòng)Ⅰ)DA和Tyr的濃度與安靜時(shí)相比雖有增加,但增幅不大;當(dāng)運(yùn)動(dòng)至力竭前45 min時(shí),DA和Tyr的濃度開始顯著增高,力竭時(shí)達(dá)到安靜狀態(tài)的1.5倍以上(P<0.05,P<0.01),且在運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的恢復(fù)期仍保持繼續(xù)增長趨勢(shì)(P<0.05,P<0.01),恢復(fù)90min時(shí),DA濃度達(dá)安靜時(shí)的3倍以上。

Fig.4 Variation of Tyr and DA in rats striatum during exhaustive exercise(n=6)

2.3 力竭運(yùn)動(dòng)過程及恢復(fù)期大鼠紋狀體DA/5-HT的變化

力竭運(yùn)動(dòng)過程及恢復(fù)期大鼠紋狀體細(xì)胞外液中DA/5-HT的動(dòng)態(tài)變化見圖5。從圖中可見,運(yùn)動(dòng)開始DA/5-HT出現(xiàn)升高趨勢(shì),在運(yùn)動(dòng)15 min和30min時(shí)達(dá)到最高水平(P<0.05,P<0.01);之后開始下降,運(yùn)動(dòng)Ⅱ基本呈持續(xù)下降趨勢(shì),直至力竭;而恢復(fù)期內(nèi)基本保持平穩(wěn)狀態(tài),力竭和恢復(fù)期與安靜狀態(tài)相比均沒有顯著性差異。

Fig.5 The variation of DA/5-HT in rats striatum during exhaustive exercise(n=6)

3 討論

5-HT是中樞一種重要的抑制性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。腦部5-HT能神經(jīng)元胞體主要集中于中腦下部、腦橋上部和延髓中縫核,其神經(jīng)纖維可投射到下丘腦和紋狀體等部位[3]。腦中的5-HT是由血液中的Trp進(jìn)入5-HT能神經(jīng)元后在色氨酸羧化酶(TPH)作用下合成的,并主要經(jīng)單氨氧化酶(MAO)催化將5-羥吲哚乙醛轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K產(chǎn)物5-HIAA途徑進(jìn)行分解。因此,Trp是5-HT合成的前體,5-HIAA是其主要的代謝產(chǎn)物。Newsholme等首次提出神經(jīng)遞質(zhì)是中樞疲勞的潛在調(diào)節(jié)物,并根據(jù)5-HT在腦內(nèi)的作用與變化將其視為中樞疲勞的可能性介質(zhì)。推測(cè)腦內(nèi)5-HT濃度增加會(huì)對(duì)中樞向外周發(fā)放神經(jīng)沖動(dòng)產(chǎn)生一定的影響,從而引起運(yùn)動(dòng)能力下降[5]。本研究采用活體微透析結(jié)合毛細(xì)管電泳—激光誘導(dǎo)檢測(cè)技術(shù),通過在體直接分段取樣的方法揭示了大鼠在一次性力竭運(yùn)動(dòng)過程及恢復(fù)期紋狀體細(xì)胞外液中5-HT濃度的動(dòng)態(tài)變化特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在運(yùn)動(dòng)開始至30min(運(yùn)動(dòng)Ⅰ),5-HT濃度未出現(xiàn)明顯改變,此時(shí)大鼠體力充沛,能較好地跟隨跑臺(tái)進(jìn)行自主運(yùn)動(dòng);之后當(dāng)遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)至力竭前45 min時(shí)(運(yùn)動(dòng)II),5-HT濃度則出現(xiàn)迅速增長并一直持續(xù)至力竭,此時(shí)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力出現(xiàn)明顯下降,必須依靠聲、光、電等外部輕微刺激繼續(xù)運(yùn)動(dòng)直至力竭。上述結(jié)果表明,紋狀體細(xì)胞外液中5-HT濃度的改變與大鼠的運(yùn)動(dòng)能力有密切的關(guān)系。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),Trp和5-HIAA的變化趨勢(shì)與5-HT基本相同。提示:在力竭運(yùn)動(dòng)過程中,紋狀體細(xì)胞外液中5-HT處于不斷合成與分解的動(dòng)態(tài)變化之中,劉蓓蓓等人[6]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。分析其原因,可能與運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致血漿中以結(jié)合形式存在的Trp大量釋放,引起游離Trp(f-Trp)增多有關(guān),f-Trp可以通過血腦屏障被5-HT能神經(jīng)元攝取合成5-HT。此外,運(yùn)動(dòng)使支鏈氨基酸參與肌肉供能的數(shù)量增多,造成血漿支鏈氨基酸濃度降低,也會(huì)導(dǎo)致進(jìn)入腦內(nèi)的Trp增加,引起5-HT合成增多[6,7]。據(jù)此認(rèn)為,5-HT合成前體f-Trp增多是力竭運(yùn)動(dòng)過程中及運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期紋狀體內(nèi)5-HT升高的重要原因之一。

DA是腦內(nèi)含量較為豐富的一類興奮性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。腦內(nèi)的DA主要由黑質(zhì)產(chǎn)生,沿黑質(zhì)-紋狀體投射系統(tǒng)分布,在紋狀體DA神經(jīng)末稍的囊泡中儲(chǔ)存。Tyr是DA合成的前體,血液中的Tyr進(jìn)入腦內(nèi)后轉(zhuǎn)運(yùn)至DA神經(jīng)元內(nèi),在酪氨酸羥化酶(TH)的催化作用下再合成DA。有研究表明,力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致大鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物明顯增高[8]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)開始至30min(運(yùn)動(dòng)Ⅰ),DA濃度出現(xiàn)增高的趨勢(shì);隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)度的遞增,當(dāng)大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭前45 min時(shí)(運(yùn)動(dòng)II),DA濃度顯著升高,運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)約增高了1.5倍;Tyr的增長趨勢(shì)與DA基本一致。在DA能神經(jīng)系統(tǒng)中,DA II型受體(D2DR)具有調(diào)節(jié)DA生物合成和釋放的雙重功能[9]。實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí),運(yùn)動(dòng)疲勞使紋狀體內(nèi)DA與D2DR含量均顯著增高。DA與D2DR受體結(jié)合可激活間接通路影響錐體外系對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)[10]。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)紋狀體內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)DA和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT在運(yùn)動(dòng)過程中都呈長時(shí)間的升高趨勢(shì),而他們的合成底物Trp與Tyr均同步顯著升高,提示長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝的顯著變化的主要原因與外周血中由運(yùn)動(dòng)引起的生化指標(biāo)的變化直接相關(guān),說明了在運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的調(diào)控過程中,外周因素也起著重要的作用。運(yùn)動(dòng)性疲勞是一個(gè)外周與中樞協(xié)同交互作用的復(fù)雜過程,運(yùn)動(dòng)可能是首先通過血液一些生化指標(biāo)的變化進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生進(jìn)一步的調(diào)節(jié)機(jī)制,參與運(yùn)動(dòng)性疲勞的中樞調(diào)控。另外研究結(jié)果也提示在運(yùn)動(dòng)性疲勞的中樞調(diào)控過程中,腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可能產(chǎn)生相同的變化趨勢(shì),其中一類神經(jīng)遞質(zhì)的變化并不能很好地反映中樞的興奮與抑制狀態(tài)。所以,我們采用DA/5-HT比值來描述二者在運(yùn)動(dòng)疲勞形成和發(fā)展過程中的可能關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),力竭運(yùn)動(dòng)過程中紋狀體細(xì)胞外液中DA/5-HT比值的變化也可分為兩個(gè)階段:運(yùn)動(dòng)開始(運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Ⅰ)DA/5-HT出現(xiàn)升高趨勢(shì),運(yùn)動(dòng)15 min和30min時(shí)達(dá)到最高水平;之后比值呈下降趨勢(shì)并略低于安靜水平(運(yùn)動(dòng) II)。提示:在運(yùn)動(dòng)初期紋狀體興奮性神經(jīng)遞質(zhì)DA的作用占優(yōu)勢(shì),神經(jīng)元以興奮性功能活動(dòng)為主;而運(yùn)動(dòng)后期則以抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT作用占優(yōu)勢(shì),神經(jīng)元以抑制性功能活動(dòng)為主,且力竭運(yùn)動(dòng)引起紋狀體細(xì)胞外液中神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化需要較長時(shí)間的恢復(fù)過程。

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