茄鏈格孢菌侵染馬鈴薯葉片過程的細(xì)胞學(xué)觀察

左豫虎 史 潔 韓青梅 康振生 臺(tái)蓮梅 劉 銅

（1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；2西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

馬鈴薯早疫?。≒otato early blight）是一種由茄鏈格孢菌〔Alternaria solani（Ell.et Mart.）Jones et Grout〕引起的對(duì)馬鈴薯危害比較嚴(yán)重的病害，可以導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)區(qū)大面積減產(chǎn)，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Pelletier & Fry，1990）。該病在我國(guó)各大馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有不同程度發(fā)生，局部地區(qū)其危害程度不亞于晚疫?。畹钯t和苑風(fēng)瑞，2007）。利用組織病理學(xué)和電鏡技術(shù)研究茄鏈格孢菌與馬鈴薯互作的組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特征，可為在細(xì)胞水平上闡明茄鏈格孢菌的致病機(jī)制及馬鈴薯的抗病機(jī)制提供理論依據(jù)。Dita等（2007）對(duì)馬鈴薯早疫病病菌侵染過程進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)茄鏈格孢菌可從表皮細(xì)胞的相鄰部位直接侵入，沒有觀察到從氣孔入侵，并且發(fā)現(xiàn)侵染與品種抗性無關(guān)，但侵染后抗病品種較感病品種表現(xiàn)出明顯的過敏性壞死反應(yīng)。而在我國(guó)鮮見茄鏈格孢菌與馬鈴薯互作的組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)采用掃描和透射電鏡技術(shù)系統(tǒng)研究了茄鏈格孢菌在抗、感早疫病的馬鈴薯離體葉片上的侵染過程及超微結(jié)構(gòu)特征，旨在為從細(xì)胞水平上闡明茄鏈格孢菌的致病機(jī)制及馬鈴薯的抗病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試馬鈴薯品種為東農(nóng)303（感?。┖涂诵?號(hào)（抗病），由黑龍江省克山農(nóng)場(chǎng)馬鈴薯研發(fā)中心提供。品種抗性由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物病理研究室接種鑒定（臺(tái)蓮梅 等，2010）。

1.2 供試菌株

供試茄鏈格孢菌菌株SH0806為2008年分離自黑龍江省綏化市采集的馬鈴薯品種富津（遼寧省本溪市馬鈴薯研究所培育）的早疫病病葉，由本大學(xué)植物免疫研究室提供。。

1.3 分生孢子懸浮液的制備

試驗(yàn)于2009年10月～2010年3月在西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。用打孔器打取PDA平板上生長(zhǎng)5～7 d、直徑為5 mm的茄鏈格孢菌菌碟，接入水瓊脂平板，25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后產(chǎn)生大量分生孢子，加少量無菌水輕輕震動(dòng)，使分生孢子能夠充分的散落于水中。用血球計(jì)數(shù)板將分生孢子懸浮液的濃度調(diào)整到1.0×105個(gè)·mL-1備用。

1.4 離體葉片接種方法

選擇3～4葉期的馬鈴薯同一部位葉片，取1.3制備的孢子懸浮液10 μL，滴于葉片背面，用于透射電子顯微鏡取樣；取孢子懸浮液10 μL滴于葉片正面，用于掃描電子顯微鏡取樣，以蒸餾水接種為對(duì)照。置于放有1～2張濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗保濕培養(yǎng)。

1.5 掃描電鏡（SEM）樣品的制備與觀察

分別于接種后2、4、6、8、10 h取樣，將接種部位的葉片切成1 cm2的小塊，按康振生（1995）的方法制備樣品。葉樣經(jīng)抽真空后置于4 %的戊二醛磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1、pH 6.8）中4 ℃固定過夜，然后用相同濃度磷酸緩沖液（PBS）沖洗5～6次，每次20 min，用30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、100 %乙醇脫水，每次30 min，再用100 %丙酮脫水2次，每次30 min，最后用醋酸異戊脂置換2次，每次30 min，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥、粘樣、噴金后在JEOL-JSM-6360LV型掃描電鏡下觀察、拍照。

1.6 透射電鏡（TEM）樣品的制備與觀察

分別于接種后12、24、48、72 h取樣，將接種部位的葉片切成0.3～0.5 cm2的小塊，按康振生（1995）的方法制備樣品。葉樣經(jīng)抽真空后置于4 %戊二醛磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1、pH 6.8）中4 ℃固定過夜，然后用相同濃度磷酸緩沖液（PBS）沖洗5～6次，每次20 min，于1 %鋨酸磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1、pH 6.8）中固定2 h，用30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、100 %乙醇脫水，每次30 min，再用100 %丙酮脫水2次，每次30 min，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，在30 ℃和60 ℃下分別聚合24 h和48 h，最后用玻璃刀半薄切片定位，定位后用鉆石刀進(jìn)行超薄切片。半薄切片于光學(xué)顯微鏡下觀察侵染點(diǎn)菌絲擴(kuò)展情況并拍照，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙重染色，于JEM-1230型透射電鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 分生孢子在葉片上的萌發(fā)

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，感病品種東農(nóng) 303葉片表面未萌發(fā)的茄鏈格孢菌分生孢子形態(tài)飽滿（圖版Ⅰ-1）；在適宜培養(yǎng)條件下，接種2 h后，分生孢子開始萌發(fā)（圖版Ⅰ-2），分生孢子萌發(fā)時(shí)間在不同抗性品種葉片上無明顯差異（圖版Ⅰ-2、3、4）；分生孢子可從孢子的多個(gè)位置（頭部、側(cè)面、尾部）萌發(fā)（圖版Ⅰ-2、3、4），萌發(fā)后孢子因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗而凹陷變癟（圖版Ⅰ-3、4）；接種6 h后，抗病品種克新1號(hào)葉片上的菌絲沿葉片表面蔓延生長(zhǎng)，有些菌絲產(chǎn)生了明顯的分泌物（圖版Ⅰ-5），而有些菌絲沒有產(chǎn)生分泌物（圖版Ⅰ-6）。

圖版Ⅰ 茄鏈格孢菌分生孢子在馬鈴薯葉片上萌發(fā)的掃描電鏡圖

2.2 分生孢子在葉片上的侵入

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種 6 h后，馬鈴薯葉片表面茄鏈格孢菌菌絲大量蔓延，少數(shù)菌絲沿著寄主表皮細(xì)胞相鄰的凹陷處生長(zhǎng)（圖版Ⅱ-1）；隨著菌絲在寄主表皮細(xì)胞表面的擴(kuò)展蔓延，菌絲頂端形成附著孢，部分菌絲越過氣孔蔓延生長(zhǎng)（圖版Ⅱ-2），沒有觀察到通過氣孔侵入表皮細(xì)胞（圖版Ⅱ-2）；接種8 h后，菌絲從表皮細(xì)胞相鄰的凹陷處直接侵入感病品種東農(nóng)303葉片表皮細(xì)胞（圖版Ⅱ-3）；接種10 h后，菌絲從表皮細(xì)胞相鄰的凹陷處直接侵入抗病品種克新1號(hào)的葉片表皮細(xì)胞（圖版Ⅱ-4）。說明茄鏈格孢菌侵入感病品種比侵入抗病品種早2 h。

2.3 菌絲在寄主體內(nèi)的擴(kuò)展

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種12 h后，茄鏈格孢菌菌絲在感病寄主細(xì)胞間隙生長(zhǎng)（圖版Ⅲ-1）；接種24 h后，菌絲穿過感病寄主細(xì)胞壁，存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，細(xì)胞膜變得不連續(xù)，可能是病原菌釋放出某些物質(zhì)降解了寄主細(xì)胞膜（圖版Ⅲ-2），菌絲從一個(gè)細(xì)胞向另一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)（圖版Ⅲ-3）；接種48 h后，大量菌絲存在于感病寄主細(xì)胞內(nèi)和胞間（圖版Ⅲ-4）。

圖版Ⅱ 茄鏈格孢菌分生孢子在馬鈴薯葉片上萌發(fā)與侵入的掃描電鏡圖

圖版Ⅲ 茄鏈格孢菌菌絲在寄主體內(nèi)擴(kuò)展的透射電鏡圖

圖版Ⅳ 寄主細(xì)胞病理變化的透射電鏡圖

圖版Ⅴ 寄主細(xì)胞病理變化和茄鏈格孢菌菌絲在不同抗性品種葉片中的侵染情況

2.4 寄主組織的病理變化特征

接種24 h后，抗病品種克新1號(hào)寄主細(xì)胞壁明顯加厚（圖版Ⅳ-1），感病品種東農(nóng)303未觀察到細(xì)胞壁加厚的現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)含物已基本全部消解（圖版Ⅳ-2）；接種48 h后，抗病品種寄主細(xì)胞內(nèi)含物出現(xiàn)不同程度的消解，還可見部分細(xì)胞器（圖版Ⅳ-3、4）。與感病品種接種24 h后寄主細(xì)胞內(nèi)含物基本全部消解相比，抗病品種細(xì)胞消亡速度明顯慢于感病品種。

接種 72 h后，抗病品種細(xì)胞內(nèi)含物基本全部消解（圖版Ⅴ-1），蒸餾水接種的對(duì)照寄主細(xì)胞內(nèi)線粒體、葉綠體等各類細(xì)胞器均勻排列，清晰可見（圖版Ⅴ-2）。接種 48 h后，光學(xué)顯微鏡觀察半薄切片可見感病品種表皮細(xì)胞下侵染點(diǎn)存在大量菌絲（圖版Ⅴ-3），抗病品種表皮細(xì)胞下侵染點(diǎn)的菌絲（圖版Ⅴ-4）明顯少于感病品種。

3 結(jié)論與討論

利用光學(xué)顯微鏡、掃描和透射電子顯微鏡觀察茄鏈格孢菌侵染不同抗性馬鈴薯品種葉片的超微結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)接種2 h后，分生孢子開始萌發(fā)，分生孢子各個(gè)部位（頭部、側(cè)面、尾部）都能萌發(fā)；接種6 h后，菌絲頂端出現(xiàn)附著孢；接種8 h后，菌絲從表皮細(xì)胞間隙直接侵入感病品種表皮細(xì)胞內(nèi)，接種10 h后才進(jìn)入抗病品種表皮細(xì)胞內(nèi)；接種24 h后，感病品種表皮細(xì)胞中侵染菌絲向相鄰細(xì)胞擴(kuò)展，而此時(shí)抗病品種細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯加厚的防衛(wèi)反應(yīng)，說明抗病品種對(duì)茄鏈格孢菌的侵染有一定的抗侵入和抗擴(kuò)展能力。隨著茄鏈格孢菌在寄主細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)展，葉片發(fā)生了一系列的病理變化。接種24 h后，感病品種寄主細(xì)胞膜不連續(xù)，細(xì)胞內(nèi)含物及各類細(xì)胞器已基本全部消解，抗病品種部分消解；接種48 h后，侵入抗、感病品種寄主表皮細(xì)胞內(nèi)的菌絲數(shù)量差異明顯，感病品種菌絲量明顯多于抗病品種，抗病品種細(xì)胞內(nèi)含物此時(shí)才基本全部消解。這表明抗病品種對(duì)茄鏈格孢菌的抗性機(jī)理存在抗菌絲擴(kuò)展能力。

本試驗(yàn)中分生孢子萌發(fā)、侵入時(shí)間明顯早于Dita等（2007）報(bào)道的接種6 h后分生孢子萌發(fā)，接種24 h后菌絲直接侵入感病品種，接種36 h后菌絲直接侵入抗病品種的試驗(yàn)結(jié)果，這可能與供試菌株和寄主品種差異或與試驗(yàn)條件有關(guān)，其原因有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)抗病品種在接種24 h后出現(xiàn)細(xì)胞壁加厚的防衛(wèi)反應(yīng)，而感病品種未觀察到防衛(wèi)反應(yīng)現(xiàn)象。Dita等（2007）報(bào)道抗病品種的抗性表現(xiàn)是過敏性壞死反應(yīng)。這是分別在細(xì)胞水平和宏觀水平對(duì)抗性表現(xiàn)的分析描述，并不矛盾。

病原菌的侵入方式一般分為 3種：傷口、氣孔、直接侵入。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分生孢子萌發(fā)與品種抗性無關(guān)，部分菌絲在寄主表皮蔓延越過氣孔生長(zhǎng)，沒有觀察到菌絲通過氣孔侵入寄主的現(xiàn)象，菌絲從表皮細(xì)胞間隙直接侵入，這與Dita等（2007）的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)方法中，掃描電鏡樣品在葉片正面接種取樣，透射電鏡在葉片背面接種取樣。原因是：馬鈴薯屬雙子葉植物，葉片背面氣孔數(shù)和絨毛數(shù)明顯多于正面。正面接種掃描電鏡觀察，有利于避免絨毛茂密對(duì)觀察效果的影響；背面接種制備透射樣品，若病原菌能夠通過氣孔侵入，葉片背面氣孔數(shù)目多則利于茄鏈格孢菌的侵入。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)有些菌絲四周伴隨分泌物存在，該類分泌物的存在應(yīng)該有利于分生孢子在寄主表面的附著與萌發(fā)，對(duì)其成分和作用有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

康振生.1995.植物病原真菌的超微結(jié)構(gòu).北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社：5-74.

臺(tái)蓮梅，梁偉伶，左豫虎，金光輝，靳學(xué)慧.2010.馬鈴薯不同品種感染早疫病菌后防御酶活性變化.植物生理學(xué)通訊，46（11）：1147-1150.

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