奧美沙坦改善內(nèi)皮素誘導(dǎo)的大鼠高血壓與氧化應(yīng)激

姚 麗，徐天華，張少青，魏 敏，葛丹梅，王力寧

腎素血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)和內(nèi)皮素(Endothelin，ET)系統(tǒng)在高血壓及心血管損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1-2］。有研究顯示，ET參與 AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓［2］，而RAS在ET誘導(dǎo)高血壓中的作用尚不清楚。另有文獻(xiàn)報(bào)道，ET可刺激活性氧片段(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生［3］。本研究觀察 ET-1 誘導(dǎo)的高血壓大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)和RAS系統(tǒng)，包括血漿腎素活性(Plasma renin activity，PRA)、AngⅡ和血管緊張素原(Angiotensinogen，AGT)水平，脈管系統(tǒng)ACE和AT1受體的表達(dá)變化;同時(shí)，觀察AngⅡ受體拮抗劑(AT1receptor blockade，ARB)奧美沙坦在此模型中對(duì)血壓和氧化應(yīng)激的影響，旨在探討RAS在ET誘導(dǎo)的高血壓和氧化應(yīng)激中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5～6周雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:①對(duì)照組(1%氯化鈉慢性灌注，n=7);②ET-1慢性灌注組［2.5 pmol/(kg·min)，n=7］;③ET-1+奧美沙坦組［6 mg/(kg·d)，n=7］;④ET-1+非特異性抗高血壓藥肼苯噠嗪治療組［15 mg/(kg·d)飲水中給入，n=6］。戊巴比妥(50 mg/kg，腹腔內(nèi)注射)麻醉下，滲透性微泵(2ML2，Alza Co.)植入大鼠頸背部皮下與血管內(nèi)插管(PE-60)相連接。奧美沙坦(CS-866，日本三共制藥有限公司惠贈(zèng))隨食物給入。

Tail-cuff技術(shù)測量清醒狀態(tài)下大鼠第0、7、14天尾部血壓。第14天時(shí)斬首處死大鼠，冷凍試管(含 EDTA 5 mmol/L、依那普利20 mol/L、1，10 鄰菲咯啉1.25 mmol/L、抑胃肽A 10 mol/L)快速收集血液，用以檢測AGT和AngⅡ。另用冷凍試管(含EDTA 5 mmol/L)收集血標(biāo)本以檢測 PRA、TBARS水平?？焖賱?nèi)≈鲃?dòng)脈，去除其周圍組織，取5 mm的主動(dòng)脈環(huán)檢測產(chǎn)物，其余主動(dòng)脈標(biāo)本液氮速凍，－80℃深凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Western blotting檢測血漿AGT水平和主動(dòng)脈ACE與AT1受體的表達(dá) 10 μg蛋白質(zhì)樣品加入8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，80 V 30 min、120 V 60 min電泳結(jié)束后，在90 V 90 min、電流＜0.33 A下，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%去脂牛奶/PBS-T室溫下阻滯1 h，PBS-T洗膜2×10 min，一抗(羊抗鼠 AGT抗體，澳大利亞昆士蘭大學(xué)惠贈(zèng))1∶5 000，4℃過夜;PBS-T洗膜3×10 min，二抗(抗羊辣根過氧化物酶標(biāo)抗體1∶30 000，Sigma Co.)室溫下孵育1 h;PBS-T 洗膜3×10 min，ECL顯色系統(tǒng)顯色，曝光。NIH-IDV軟件系統(tǒng)分析圖片。主動(dòng)脈ACE與AT1受體的檢測方法及步驟同上。一抗分別為多克隆抗ACE抗體(1∶200，Santa Cruz Biotechnology Inc.)，多克隆抗 AT1受體抗體(1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology Inc.)。二抗分別為抗羊辣根過氧化物酶標(biāo)抗體(1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology Inc.);抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)抗體(1∶4 000，Cell Signaling Technology)。

1.2.2 光澤精化學(xué)發(fā)光體系檢測主動(dòng)脈超氧陰離子產(chǎn)物()5 mm主動(dòng)脈環(huán)置入37℃碳酸氫鹽緩沖液平衡30 min，37℃ Krebs-HEPES緩沖液沖洗，然后置于1 mL 37℃ Krebs-HEPES緩沖液(含光澤精20 μmol/L)，避光平衡10 min，冷光儀(BLR-301，Aloka)記錄化學(xué)發(fā)光，每30秒1次，共 15min。1，2-二 羥 基 苯-3，5-二 磺 酸 鈉(20 mmol/L)終止產(chǎn)物所致發(fā)光。記錄化學(xué)發(fā)光。加入Tiron前后的差值為Tiron可終止的光澤精化學(xué)發(fā)光，結(jié)果以每毫克干重組織每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)表達(dá)。生物化學(xué)分析法檢測血漿TBARS水平，以評(píng)估大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。放射免疫法檢測血漿PRA和AngⅡ水平。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組大鼠收縮壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，ET-1灌注使大鼠收縮壓顯著升高(P＜0.05)。奧美沙坦和肼苯噠嗪防止了ET-1誘導(dǎo)的高血壓(見圖1)。

圖1 各組大鼠收縮壓變化

2.2 ET-1誘導(dǎo)的高血壓大鼠RAS狀態(tài)

2.2.1 大鼠血漿AGT的表達(dá) 見圖2。大鼠血漿AGT有52 kD和64 kD(輕度糖基化和高度糖基化)2種形式，以52 kD表達(dá)居多。ET-1灌注未影響大鼠血漿AGT表達(dá)。與對(duì)照組比較，奧美沙坦和肼苯噠嗪都使ET-1灌注組大鼠血漿AGT表達(dá)增加(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠血漿AGT表達(dá)水平

2.2.2 與對(duì)照組比較，ET-1灌注使大鼠血漿PRA明顯升高(P＜0.05)。奧美沙坦進(jìn)一步升高了ET-1灌注大鼠血漿 PRA水平(P＜0.05)，見圖3A)。肼苯噠嗪未影響ET-1灌注大鼠血漿PRA水平。ET-1灌注使大鼠血漿AngⅡ水平顯著升高(P＜0.05，見圖3B)。奧美沙坦治療進(jìn)一步升高了ET-1灌注大鼠血漿AngⅡ水平(P＜0.05)。肼苯噠嗪未影響ET-1灌注大鼠血漿AngⅡ水平。

圖3 各組大鼠血漿PRA及AngⅡ水平

2.2.3 與對(duì)照組相比，ET-1灌注大鼠主動(dòng)脈ACE和AT1受體表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。奧美沙坦與肼苯噠嗪干預(yù)未影響ACE和AT1受體表達(dá)。

圖4 各組大鼠主動(dòng)脈ACE和AT1受體表達(dá)水平

2.3 ET-1誘導(dǎo)的高血壓大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)

2.3.1 與對(duì)照組比較，ET-1灌注使大鼠血漿TBARS水平明顯升高(P＜0.05，見圖5A)。奧美沙坦降低了ET-1灌注大鼠血漿TBARS水平(P＜0.05)。肼苯噠嗪未影響 ET-1灌注大鼠血漿TBARS水平。

圖5 各組大鼠血漿TBARS水平及主動(dòng)脈產(chǎn)物

3 討論

AngⅡ可強(qiáng)有力地刺激ET-1產(chǎn)生［1-4］。研究表明，AngⅡ慢性灌注可增加大鼠腎臟的ET-1產(chǎn)物數(shù)量，AngⅡ還可以啟動(dòng)血管平滑肌細(xì)胞ppET-1基因轉(zhuǎn)錄。另一方面，關(guān)于ET系統(tǒng)對(duì)RAS活性的影響尚不清楚。本研究中，ARB奧美沙坦防止了ET-1慢性灌注引起的高血壓，提示在本模型中，RAS系統(tǒng)被激活，并參與了ET-1誘導(dǎo)的高血壓。ET-1慢性灌注使大鼠血漿PRA、AngⅡ水平顯著增加，而血漿AGT水平、血管ACE和AT1受體表達(dá)無變化，提示血漿PRA增加是血漿AngⅡ增高的原因。ET-1慢性灌注使大鼠血漿PRA增加的機(jī)制尚不清楚。有研究顯示［5-6］，ET-1急性灌注使腎小球入球小動(dòng)脈收縮，腎血流量減少，腎小球?yàn)V過率下降，腎血管阻力顯著增加，提示血漿PRA增加可能是由于腎血管持續(xù)收縮，腎小球?yàn)V過率下降，或隨后出現(xiàn)的腎損害引起。其他可能機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

有報(bào)道，ET誘導(dǎo)的血管收縮至少部分是通過增加ROS產(chǎn)物介導(dǎo)的［7-8］。筆者發(fā)現(xiàn)，ET-1慢性灌注使大鼠血管產(chǎn)物和血漿TBARS水平顯著增加。ET-1刺激ROS產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確。有報(bào)道，ET-1增加血管內(nèi)皮細(xì)胞gp91phox表達(dá)和產(chǎn)物［9］。同時(shí)，ET-1是蛋白激酶C的強(qiáng)刺激物，而蛋白激酶C參與NAD(P)H氧化酶激活和產(chǎn)生［10］。本研究結(jié)果顯示，ARB奧美沙坦防止了ET-1誘導(dǎo)的高血壓和ROS產(chǎn)生。雖然有多種機(jī)制參與ET誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，但至少可以推測，AngⅡ部分參與了ET-1慢性灌注誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。同時(shí)，非特異性抗高血壓藥物肼苯噠嗪并未改變ET-1慢性灌注大鼠血漿TBARS的水平，但顯著減少了血管產(chǎn)物。提示2種可能性:第一，肼苯噠嗪本身具有抗氧化性;第二，ROS水平降低是肼苯噠嗪降壓作用的結(jié)果。目前的研究結(jié)果尚不能證實(shí)肼苯噠嗪具有抗氧化作用。

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