一個支持芥藍(lán)起源于中國的分子證據(jù)

王冬梅 陳 琛，2 王慶彪 莊 木* 劉玉梅 楊麗梅張揚(yáng)勇 方智遠(yuǎn)

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109）

芥藍(lán)（Brassica oleracea var. alboglabra Baily），又名白花芥藍(lán)、芥蘭，是十字花科蕓薹屬一年或兩年生草本植物，2n=18，在我國廣東、廣西、福建和臺灣等地廣泛種植（Panda et al.，2003；秦耀國 等，2009；張平真，2009；周禹 等，2010）。有關(guān)甘藍(lán)類作物起源和親緣關(guān)系的信息多數(shù)來自史料記載（Helm，1963；Thompson，1976；張平真，2009）：普通結(jié)球甘藍(lán)和紫甘藍(lán)大約在13世紀(jì)起源于德國；皺葉甘藍(lán)可能原產(chǎn)于意大利；抱子甘藍(lán)形成于比利時的布魯塞爾；Boswell（1949）認(rèn)為球莖甘藍(lán)是15世紀(jì)在歐洲北部演化而成；花椰菜可能是在1490年由熱那亞人從黎凡特或者塞浦路斯引入意大利；青花菜由黎凡特、塞浦路斯或者克里特島引入意大利；芥藍(lán)的起源有中國南方起源說和地中海沿岸起源說兩種，尚缺乏充分的分子生物學(xué)證據(jù)。

SSR標(biāo)記由于其多態(tài)性好以及共顯性的特點(diǎn)（Powell et al.，1996），越來越多地應(yīng)用于基因標(biāo)記、圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等方面（陳全求 等，2008）。與基因組SSR相比，EST-SSR作為功能基因的一部分，在功能基因鑒定和種間通用性上更有其優(yōu)越性（Gupta et al.，2003）。本試驗(yàn)利用甘藍(lán) EST-SSR標(biāo)記，對芥藍(lán)、野生甘藍(lán)、觀賞羽衣甘藍(lán)、苤藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、結(jié)球甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、青花菜和花椰菜等甘藍(lán)類材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，比較芥藍(lán)與其他甘藍(lán)類作物之間的親緣關(guān)系，為芥藍(lán)起源提供分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料包括甘藍(lán)類作物自交系、地方品種、一代雜種和野生甘藍(lán)等38份。其中3份野生甘藍(lán)由英國國際園藝研究中心（Warwick HRI，UK）引進(jìn)，5份芥藍(lán)地方品種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)雷建軍教授提供，花椰菜由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所花椰菜課題組提供，其余材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍(lán)課題組收集、提供（材料編號和名稱見表 1）。所有材料于2009、2010年定植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南口實(shí)驗(yàn)農(nóng)場，在芥藍(lán)成熟期調(diào)查其植物學(xué)性狀，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照《芥藍(lán)種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》（李錫香和方智遠(yuǎn)，2008）。苗期取幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA。

表1 供試38份甘藍(lán)類材料名稱、類型及來源

1.2 EST-SSR分析

試驗(yàn)所用EST-SSR引物參見陳琛等（2010）的文獻(xiàn)，利用8份不同甘藍(lán)變種的材料進(jìn)行引物初篩，篩選出61對EST-SSR引物，并對所有38份材料進(jìn)行擴(kuò)增分析。PCR反應(yīng)體系為10μL，其中包括：200μmol·L-1dNTPs，上鏈和下鏈引物各2.5 pmol，0.5 U Taq酶，1×Buffer（內(nèi)含1.5mmol·L-1MgCl2），25 ng DNA模板，所用試劑均購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性30 s，合適溫度退火30 s，72 ℃延伸1min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7min。各引物的合適退火溫度根據(jù)引物合成報告單而定。8 %聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，160 V恒壓。快速銀染法染色。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為999。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，每塊膠板均由兩人獨(dú)立記錄，然后比對，有爭議的數(shù)據(jù)作缺失處理。應(yīng)用NTSYSpc2.11軟件采用非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，得到遺傳相似系數(shù)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)建立聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR擴(kuò)增分析

本試驗(yàn)利用8個具有代表性的材料對EST-SSR引物多態(tài)性進(jìn)行篩選，共得到61對擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、品種間帶型差異較明顯、易于識別的引物。用這61對EST-SSR引物對38份甘藍(lán)類材料擴(kuò)增，共擴(kuò)增出174條多態(tài)性條帶，每對引物擴(kuò)增的等位位點(diǎn)數(shù)不等，變幅為1～5，平均每對引物擴(kuò)增2.86條帶，引物多態(tài)性總體較好。其中，引物BoE332在38份材料中的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 引物BoE332在部分甘藍(lán)類作物中的SSR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 芥藍(lán)與其他甘藍(lán)類作物EST-SSR標(biāo)記的聚類分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果建立數(shù)據(jù)矩陣后用NTSYSpc2.11軟件計(jì)算不同甘藍(lán)變種間的遺傳相似系數(shù)，UPGMA法進(jìn)行聚類分析得到38份甘藍(lán)類材料的聚類分析樹狀圖（圖2）。

由圖2可知，在相似系數(shù)大約為0.62處，所選甘藍(lán)材料按地域分為三大類群：Ⅰ野生甘藍(lán)、觀賞羽衣甘藍(lán)、結(jié)球甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、苤藍(lán)和抱子甘藍(lán)。這幾類除皺葉甘藍(lán)外，其他的在史料記載中均起源于歐洲西北部沿海地區(qū)。Ⅱ青花菜和花椰菜。起源于地中海沿岸。Ⅲ芥藍(lán)。首先作為一個單獨(dú)的類群聚出，表明其與前兩大類群的甘藍(lán)類植物在進(jìn)化途徑上有所不同，推測其起源于中國南方。

在相似系數(shù)約為0.77處，13份芥藍(lán)材料可分為三類（圖2）。東升芥藍(lán)（38）是一高代自交系，聚為第一類。桃山中花（31）可葉、薹兼用，本地鐵種（32）為葉用芥藍(lán)，均表現(xiàn)為葉形橢圓、葉面平滑，聚為第二類。其余為第三類，這類材料除長葉中熟（35）葉形為橢圓外，其他材料特點(diǎn)是葉形寬卵圓，葉面皺縮；老種香菇（34）、長葉中熟為薹用類型，其中長葉中熟的主薹為紫紅色，側(cè)薹商品性好；日本綠（36）來自于日本，與老種香菇、長葉中熟的親緣關(guān)系較近；香港遲花（37）來自香港，與矮腳筷（33）的親緣關(guān)系較近。芥藍(lán)的植物學(xué)性狀見表2。

圖2 基于EST-SSR分析的38份甘藍(lán)類材料聚類樹狀圖

表2 芥藍(lán)植物學(xué)性狀調(diào)查結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)將芥藍(lán)分為三類，除高代自交系東升芥藍(lán)獨(dú)為一類外，其他兩類與Okuda和Fujime（1996）根據(jù)植物學(xué)性狀的分類結(jié)果及Matsui等（2002）的RAPD分析結(jié)果基本一致，主要是根據(jù)葉形和葉面進(jìn)行分類。

芥藍(lán)的起源現(xiàn)存有兩種觀點(diǎn)，一是中國南方起源說，在中國目前能追溯到的最早有關(guān)芥藍(lán)的記載是宋朝蘇東坡（1037～1101）的詩句“芥蘭如菌蕈，脆美牙頰響”，距今已有 900多年的歷史；而《中國蔬菜栽培學(xué)》（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，1987）記載最早引進(jìn)中國的結(jié)球甘藍(lán)和花椰菜，也只有300余年的歷史，說明芥藍(lán)可能原產(chǎn)于中國；張平真（2009）綜合了各種史學(xué)資料認(rèn)為芥藍(lán)為甘藍(lán)的一個變種，并支持芥藍(lán)起源于中國南方的說法。二是地中海沿岸地區(qū)起源說，支持這一學(xué)說代表著作有《植物學(xué)》（中山大學(xué)和南京大學(xué)，1984）和《中國的蔬菜》（章厚樸，1988）。本試驗(yàn)中芥藍(lán)首先作為一個單獨(dú)的類群與其他甘藍(lán)類作物分開，表明芥藍(lán)與其他甘藍(lán)類作物可能是由不同路線進(jìn)化而來。野生甘藍(lán)、觀賞羽衣甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、結(jié)球甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、苤藍(lán)、抱子甘藍(lán)起源于歐洲西北部沿海地區(qū)；青花菜和花椰菜起源于地中海沿岸；芥藍(lán)獨(dú)立于歐洲西北部類群和地中海沿岸類群，推測其可能起源于中國。有記載早在公元前5、6世紀(jì)，一種被稱為“西土藍(lán)”的甘藍(lán)類作物傳入中國（張平真，2006），在我國副熱帶氣候條件下，逐漸選育形成芥藍(lán)；Song等（1988）的 RFLP研究中芥藍(lán)為單獨(dú)一類，與千頭羽衣甘藍(lán)親緣關(guān)系較近，被認(rèn)為是一種較為原始的類型，可能起源于一種由西歐傳到東亞的原始羽衣甘藍(lán)；本試驗(yàn)中芥藍(lán)作為一個單獨(dú)的類群首先聚出，與其他甘藍(lán)材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是芥藍(lán)進(jìn)化形成時間較早，且進(jìn)化形成的地域與其他甘藍(lán)類作物隔離，支持芥藍(lán)起源于中國的說法。本試驗(yàn)中選用的野生甘藍(lán)都屬于Brassica oleracea，全部來自英國，均聚于歐洲西北部沿海類群，表明羽衣甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、結(jié)球甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、苤藍(lán)、抱子甘藍(lán)可能都起源于野生甘藍(lán)（Brassica oleracea）；而至于芥藍(lán)的祖先，還需進(jìn)一步收集范圍更廣的野生甘藍(lán)和近緣野生二倍體進(jìn)行分析。

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