副豬嗜血桿菌江西分離株藥物敏感性及四環(huán)素耐藥基因tet(B)分析

宋德平，肖根輝，王 萍，何后軍，鄔向東，黃冬艷，鄧舜洲，張文波

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，江西 南昌 330045)

副豬嗜血菌(Haemophilus parasuis，Hps)是格拉澤氏病(Glasser's disease)的病原菌，是健康豬上呼吸道的常在菌，在機(jī)體受應(yīng)激或感染導(dǎo)致免疫力下降時(shí)引起保育仔豬及青年豬發(fā)生纖維素性多發(fā)性漿膜炎[1]。近年來，豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等免疫抑制性疾病常繼發(fā)Hps感染而增加發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[2]。

Hps分為15個(gè)血清型，各血清型間缺乏有效的交叉保護(hù)力，常由于疫苗血清型與發(fā)病菌血清型不同而導(dǎo)致免疫失敗。所以，目前多用藥物進(jìn)行預(yù)防和治療。但這也使得該菌對(duì)藥物的敏感性發(fā)生改變。報(bào)道顯示，近些年來Hps的耐藥性越來越嚴(yán)重，而且不同時(shí)間不同地域分離株的藥物敏感性存在較大的差異[3-5]。獲得關(guān)于Hps的藥物敏感性信息將有助于該地區(qū)對(duì)該菌引發(fā)疾病的防制。

目前，關(guān)于Hps耐藥機(jī)制的研究較少。已報(bào)道的有四環(huán)素耐藥基因tet(B)、青霉素耐藥基因blaROB及林可胺類耐藥基因lnu(C)，這些耐藥基因均位于質(zhì)粒中[6-7]。檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因(tet)是檢測(cè)四環(huán)素耐藥性的重要手段。在眾多tet中，tet(B)是介導(dǎo)腸道菌四環(huán)素耐藥性的重要基因[8-9]。Lancashire等在對(duì)澳大利亞分離株耐藥性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)介導(dǎo)四環(huán)素耐藥的質(zhì)粒pHS-Tet和pHS-Rec，均含有tet(B)[5]。前者還含有一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)基因mobABC，提示Hps的四環(huán)素耐藥性可能是獲得性的。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了20株江西株的藥物敏感性，獲得對(duì)江西株敏感的藥物，從而為該菌的防制提供依據(jù)。同時(shí)設(shè)計(jì)特異性引物檢測(cè)tet(B)，為研究江西株耐藥的分子機(jī)制及其與血清型和毒力之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 待檢測(cè)菌株 2008年11月～2010年3月從江西省4個(gè)市32個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的80份發(fā)生纖維素性心包炎、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎的經(jīng)臨診為Hps感染的病例中分離得到20株革蘭氏陰性、細(xì)小的多形態(tài)桿菌。經(jīng)細(xì)菌形態(tài)、生化鑒定及PCR鑒定確定為Hps，并由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 TSA和TSB購自DficoTM公司；新生小牛血清購自杭州四季青有限公司；NAD購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙片、青霉素G等共9大類57種抗生素購自杭州天和微生物試劑有限公司；ExTaqDNA聚合酶和dNTPs購自北京全式金生物有限公司；600 bp DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 DNA Ladder購自北京天根生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基 每100 mL TSA和TSB培養(yǎng)基中各加入經(jīng)過濾除菌的0.05%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)1 mL及無菌新生小牛血清5 mL，混勻后立即傾倒平板。

1.4 菌株的復(fù)壯 將保存菌種以100 μL 37℃TSB溶解后接種于含NAD及新生小牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后挑取單個(gè)菌落接種于新平板上，過夜培養(yǎng)。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn) 挑取復(fù)壯后的菌落3個(gè)～5個(gè)接種于TSB培養(yǎng)基中，每株菌接種2管～3管，37℃180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。將菌液調(diào)至與麥?zhǔn)媳葷峁艿?管(大約3×108cfu/mL)一致。將制備的菌液涂布TSA培養(yǎng)基，于恒溫箱內(nèi)作用15 min，待液體稍干后貼標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙片。37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑，并重復(fù)1次，取其平均值為最終抑菌直徑。依據(jù)CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，區(qū)分為耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)3種藥物感受態(tài)。

1.6 tet(B)的PCR檢測(cè) 根據(jù)NCBI登錄的標(biāo)準(zhǔn)序列(AY862435.1)設(shè)計(jì)引物，Tet(B)-1a：5'-TGGTTA GGGGCAAGTTTTGG-3'，Tet(B)-1b：5'-GAGCATTG GTAAGGCTC-3'，預(yù)期目的條帶大小為640 bp，由Invetrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；95℃ 60 s、50℃ 60 s、72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性產(chǎn)物由上海英俊生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。并進(jìn)行特異性和靈敏度試驗(yàn)。采用建立的方法對(duì)江西株進(jìn)行tet(B)分析。

2 結(jié) 果

2.1 Hps江西株的藥物敏感性試驗(yàn) 參照CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果，各分離株對(duì)各藥物的敏感性存在一定的差異。其中，對(duì)該菌敏感性較好的藥物有：氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、頭孢呋辛、頭孢噻吩、阿奇霉素、左氟沙星及奈替米星。所有試驗(yàn)菌株對(duì)阿洛西林、萬古霉素均高度敏感。80%及以上的分離株對(duì)氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、頭孢洛克、頭孢呋辛、頭孢噻吩、妥布霉素、阿奇霉素、左氟沙星、奈替米星等高度敏感。所有菌株對(duì)頭孢菌素的敏感性較高，在使用的14種頭孢菌素中除頭孢唑林和頭孢曲松敏感性較差外，其他藥物的敏感率為65%～90%(表1)。

表1 HPs江西株的藥物敏感性分析Table 1 Analysis of drug sensitivity in Hps Jiangxi isolates

2.2 Hps江西株的耐藥性 20株試驗(yàn)菌存在不同程度的耐藥性，其中，對(duì)恩諾沙星、氨曲南、四環(huán)素、頭孢唑林、洛洛美沙星、青霉素G、羧芐青霉素、頭孢曲松、鏈霉素及林可霉素的耐受性較強(qiáng)(表2)。全部菌株均對(duì)多種藥物具有抗性，部分菌株能夠耐受5種以上的藥物，甚至有2株菌能夠耐受多達(dá)22種藥物(表2)。

2.3 Hps江西株的耐藥性與血清型之間的關(guān)系 20株江西分離株對(duì)抗生素均存在耐藥性，每一種血清型均存在耐藥菌株。由表3可見，高毒力血清型(血清4型、5型和13型)的耐藥頻數(shù)為69，占總耐藥頻數(shù)的60%，比中低毒力及無毒力血清型的耐藥頻率高，血清4型菌株的耐藥頻率與其血清型頻率相差較大，可能是由于臨床用藥種類與本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)藥物不同所致。經(jīng)卡方檢驗(yàn)表明高毒力菌株與中低毒力及無毒力血清型的耐藥性差異不顯著(p>0.05)。3株不可分型菌株的耐藥頻數(shù)為28，占總耐藥頻數(shù)的24.35%(圖 1)。

2.4 Hps江西株與其他分離株的藥物敏感性比較本實(shí)驗(yàn)江西株的耐藥性普遍高于其他研究報(bào)道結(jié)果。與Zhou等的結(jié)果比較，耐藥性增幅較大的藥物有：青霉素、氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素[10]。而青霉素、氨芐西林曾被認(rèn)為是治療Hps病較為有效的藥物，長期的大量使用勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致耐藥性的積累。四環(huán)素和慶大霉素也是豬場(chǎng)的常用藥物。本研究與其他國家分離株相比也存在很大的耐藥性差異，整體的耐藥性比英國分離株強(qiáng)，但與西班牙分離株相近。除對(duì)恩諾沙星的耐藥性遠(yuǎn)高于西班牙分離株外，對(duì)青霉素、氨芐西林、磺胺甲惡唑/TMP等藥物的耐藥性略低于西班牙分離株，而對(duì)頭孢噻呋和恩諾沙星的耐藥率高于西班牙分離株。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果再一次證實(shí)了不同地區(qū)、不同時(shí)間分離的菌株藥物敏感性存在較大的差異。

表2 Hps江西株的耐藥表型Table 2 Resistence phenotype of Hps isolates from Jiangxi Province

表3 Hps江西株血清型與耐藥頻率分布Table 3 Distribution foH.parasuisserovars and antimicrobial antimicrobial resistance among different serovars

2.5 tet(B)PCR檢測(cè)方法的建立 應(yīng)用本研究建立的方法從江西分離株中對(duì)耐四環(huán)素的Hps中擴(kuò)增出大小約為640 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期相符，產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)比對(duì)表明所擴(kuò)增的條帶為tet(B)，與NCBI上登錄的tet(B)基因序列同源性為97%～98%(圖2)。所建立的方法具有較高的靈敏度，最少檢出菌量為10-3cfu(圖3)。特異性試驗(yàn)表明該方法只能擴(kuò)增出對(duì)四環(huán)素耐藥的Hps中的tet(B)基因，不能從對(duì)四環(huán)素敏感的Hps中檢測(cè)出該基因，也不能檢測(cè)出對(duì)四環(huán)素耐藥的鏈球菌、葡萄球菌、巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬沙門氏菌中的耐藥基因tet(B)(圖4)。

2.6 Hps江西株四環(huán)素耐藥基因tet(B)的檢測(cè) 運(yùn)用建立的方法檢測(cè)20株江西分離株的tet(B)基因。結(jié)果表明，在14株對(duì)四環(huán)素耐藥的菌株中，有8株菌存在tet(B)基因，7株四環(huán)素敏感菌株中未檢出該基因，另外有一株未進(jìn)行血清分型但對(duì)四環(huán)素有抗性的景德鎮(zhèn)分離株也檢測(cè)到了tet(B)基因。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了20株江西株對(duì)57種藥物的敏感性，系統(tǒng)地研究了Hps江西株的藥物敏感性。結(jié)果表明存在一些對(duì)江西株高度敏感的藥物，這些藥物可以用于豬場(chǎng)對(duì)該病進(jìn)行預(yù)防和治療。但江西株也存在較為嚴(yán)重的耐藥性，與其他不同地區(qū)和時(shí)間段分離株相比，江西株對(duì)四環(huán)素、青霉素及恩諾沙星等的耐藥性大大增加。全部菌株均存在多重耐藥，但大多在5種藥物以下，有部分菌株能夠耐受5種以上的藥物，甚至有2株菌能夠耐受多達(dá)22種藥物，這可能與現(xiàn)今養(yǎng)豬業(yè)大量不合理的使用抗生素有關(guān)。研究報(bào)道，在細(xì)菌分離之前使用藥物治療對(duì)細(xì)菌的分離以及分離菌對(duì)藥物的抗性有較大影響。因此，文獻(xiàn)報(bào)道中的差異非常大的抗藥性很可能與細(xì)菌分離前使用抗生素有關(guān)[11]。本研究采集的樣品前期大多使用抗生素治療過，但這也許更真實(shí)地反應(yīng)當(dāng)前分離株對(duì)藥物的耐受情況。

四環(huán)素是豬場(chǎng)經(jīng)常使用的保健和治療藥物，其作用機(jī)理主要通過阻止氨酰tRNA與細(xì)菌核糖體結(jié)合來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成[11]，但不影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞核糖體及細(xì)胞功能。自1980年Mender等第一次在腸桿菌科和假單胞菌質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因以來，在多種病原菌內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定至少29個(gè)不同的tet基因和3個(gè)otr基因[12]。四環(huán)素耐藥性的分布存在多樣性，不同細(xì)菌、宿主種類及地理位置等都表現(xiàn)出四環(huán)素耐藥基因的差異。一般認(rèn)為，革蘭氏陰性基因細(xì)菌的耐藥機(jī)制以抗生素的導(dǎo)出泵機(jī)制為主，對(duì)豬體內(nèi)細(xì)菌及腸道細(xì)菌而言，其決定導(dǎo)出泵的耐藥性基因以tet(B)為主[13]。本研究建立了檢測(cè)tet(B)的PCR方法，并從20株江西分離株中檢測(cè)出9株菌含tet(B)基因，表明tet(B)是介導(dǎo)HPs對(duì)四環(huán)素耐藥的主要原因之一，但還可能存在其他的機(jī)制介導(dǎo)這些菌株對(duì)四環(huán)素的耐藥性，這有待于進(jìn)一步研究。

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