靶向VP1和VP2雙拷貝shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的研究

歐陽偉，王永山*，馬金榮,，張海彬

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一種危害雛雞的急性高度接觸性傳染病。IBDV感染不僅可導(dǎo)致患病雞死亡，而且引起雞的免疫抑制，造成疫苗免疫失敗[1-7]。

IBDV屬于雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，基因組包括大(A)小(B)兩個(gè)片段。VP1是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，由B片段編碼的一種依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)，與病毒RNA的復(fù)制和毒力有關(guān)[8-10]。VP2是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，由A片段編碼的多聚蛋白加工而成，位于病毒粒子的外表面，占總結(jié)構(gòu)蛋白量的51%，屬于病毒的主要保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異以及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等有關(guān)[11]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)能夠使mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默[12-13]。RNAi被認(rèn)為是機(jī)體阻止外來病毒感染、保護(hù)細(xì)胞免受病毒入侵的一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制[14]。

本實(shí)驗(yàn)室前期的研究采用體外轉(zhuǎn)錄的方法分別制備了3個(gè)靶向VP1和3個(gè)靶向VP2的小干擾RNA(Short interfering RNA，siRNA)，在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中的功能分析表明，3個(gè)VP1-siRNA和3個(gè)VP2-siRNA均能明顯抑制IBDV復(fù)制，其中VP1-siRNA2550和VP2-siRNA392的抑制效果最為顯著[15]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇這兩個(gè)高效siRNA，構(gòu)建了由chU6啟動(dòng)的靶向IBDV VP1和VP2基因的雙拷貝shRNAs重組表達(dá)質(zhì)粒，鑒定其在CEF及雞胚中對IBDV復(fù)制的抑制效果，為新型抗IBDV生物制劑與疫苗設(shè)計(jì)探索新的技術(shù)途徑。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要試劑 IBDV B87 CEF適應(yīng)病毒株和雞胚適應(yīng)病毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存；9日齡～10日齡SPF雞胚購自南京天邦生物科技有限公司；pSilencer 2.1-U6 neo購自Ambion公司；SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒、MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司。

1.2 雞U6啟動(dòng)子(chU6)的克隆 根據(jù)已發(fā)表的chU6基因序列(DQ531569)設(shè)計(jì)引物，chU6(F)：5'-CGGAATTCACGCGTCGACGCGGCCGCGACAAC ACAAGCATCGAG-3'； chU6(R)： 5'-CCCAAGCTT CCGCTCGAGCGGGATCCTAGTATATGTGCTGCCG AAGCGAGCACGGAC-3'。上游引物引入 EcoRⅠ、SalⅠ位點(diǎn)，下游引物引入HindⅢ、XhoⅠ、BamHⅠ位點(diǎn)，引物由Invitrogen公司合成。

取60日齡的來航雞肝臟組織，按TIANDZ公司的柱式動(dòng)物DNAout說明書提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增chU6啟動(dòng)子序列，克隆于pMD18-T載體中，EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切分析，獲得含chU6啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pMD-chU6并進(jìn)行測序分析。

1.3 靶向VP1和VP2基因的shRNA分子設(shè)計(jì)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[15]和shRNA設(shè)計(jì)原則[16]，選擇IBDV VP1基因(DQ403249)的2550序列和VP2基因(AF508177)的392序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)編碼shRNA的正義和反義鏈DNA序列，退火形成雙鏈DNA，插入RNAi表達(dá)載體pSilencer 2.1-U6 neo，同步設(shè)立無shRNA的陰性對照。序列設(shè)計(jì)見表1和圖1。

表1 編碼shRNA的DNA序列Table 1 DNA sequence encoding shRNA

圖1 shRNA的設(shè)計(jì)Fig.1 Design of the shRNA

1.4 雙向chU6啟動(dòng)子雙拷貝shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將合成的編碼VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392的正向和反向互補(bǔ)單鏈DNA序列分別退火(圖1)，得到VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392雙鏈DNA。將其分別插入pMD-chU6的BamHⅠ與XhoⅠ位點(diǎn)，分別獲得pMD-chU6-VP1shRNA2550和pMD-chU6-VP2shRNA392重組質(zhì)粒。用XhoⅠ單酶切pMD-chU6-VP2shRNA392，SalⅠ與XhoⅠ雙酶切pMD-chU6-VP1shRNA2550，回收pMD-chU6-VP2shRNA392片段和chU6-VP1shRNA255片段，連接，轉(zhuǎn)化，BamHⅠ單酶切分析，獲得pMD-2chU6-VP1VP2shRNA。將pMD-2chU6-VP1VP2shRNA和表達(dá)載體pSilencer 2.1-U6 neo分別用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，回收2chU6-VP1VP2shRNA片段與pSilencer 2.1-U6 neo片段，連接，轉(zhuǎn)化，EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切分析，獲得雙chU6啟動(dòng)子雙shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒pSilencer2.1-2chU6-VP1VP2shRNA(中國發(fā)明專利申請?zhí)枺?01110127319.7)，簡稱為：pchU6-shRNA12(圖2)。同步構(gòu)建不含shRNA的對照質(zhì)粒pchU6-CON。

圖2 雙chU6啟動(dòng)子雙shRNA表達(dá)質(zhì)粒的分子圖譜Fig.2 Schematic diagram of the recombinant plasmid pchU6-shRNA12

1.5 pchU6-shRNA12在CEF中體外抑制IBDV試驗(yàn) 試驗(yàn)在6孔板上進(jìn)行，按Lipofectamine2000說明書操作方法將 pchU6-shRNA12(4μg/孔)轉(zhuǎn)染CEF，24 h后接種103TCID50的IBDV(B87株)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞病變(CPE)，收集CEF培養(yǎng)物，凍融3次，測定病毒滴度，用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。實(shí)驗(yàn)同步設(shè)立pchU6-CON轉(zhuǎn)染CEF、病毒感染和正常CEF對照組。

1.6 pchU6-shRNA12在雞胚中抑制IBDV試驗(yàn)將 pchU6-shRNA12(8 μg/ 胚 )與 IBDV(103TCID50/胚)混合，一起接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔中，同步設(shè)立pchU6-CON以及單獨(dú)接種IBDV對照組。觀察雞胚生長和發(fā)育狀況，96 h后，收集雞胚組織和尿囊液，接種10日齡SPF雞胚，測定病毒滴度，用Reed-Muench法計(jì)算病毒的ELD50。

根據(jù)IBDV VP1基因、VP2基因和雞β-actin基因(作為內(nèi)參對照)序列設(shè)計(jì)引物(表2)，引物由上海Invitrogen公司合成。

表2 熒光定量RT-PCR引物Table 2 Primers for real time quantitative RT-PCR

用TRIzol試劑方法提取雞胚組織和尿囊液混合物的總RNA，按照SYBR PrimeScript RT-PCR Kit使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA用EASY Dilution按10倍梯度稀釋，再將各稀釋度的cDNA作為模板進(jìn)行SYBR GreenⅠreal-time PCR擴(kuò)增，以β-actin基因作為內(nèi)參照。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為LightCycler 480Ⅱ(Roche公司)，擴(kuò)增結(jié)果采用Roche LightCycler 480 SW1.5.0軟件做相對定量分析，計(jì)算抑制效率。

2 結(jié) 果

2.1 chU6啟動(dòng)子的克隆 以雞的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得約為600 bp的chU6啟動(dòng)子，將其克隆于pMD18-T中，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切分析，可見2條長度分別約600 bp和2700 bp的DNA片段，與chU6基因片段(593 bp)和pMD18-T載體大小理論值相符合(圖3)。

圖3 pMD-chU6的酶切圖譜Fig.3 Identification of pMD-chU6

2.2 chU6的生物信息學(xué)分析 將測定的chU6啟動(dòng)子序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，chU6啟動(dòng)子173-566位核苷酸序列(GenBank中登錄號：JN127375)與已發(fā)表的雞U6(DQ531569)啟動(dòng)子序列同源性為96%，而與人源的U6啟動(dòng)子(人染色體15∶NCBI35∶15∶65919386∶65919660∶-1)同源性為 6.2%，與鼠源的 U6啟動(dòng)子(鼠染色體 9∶NCBIM33∶9∶63370029∶63370291∶1)同源性為 9.9%。用 TFSEARCH分子生物學(xué)軟件對克隆的chU6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，有4個(gè)潛在的Oct-1結(jié)合位點(diǎn)和其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，含有RNA聚合酶Ⅲ的3個(gè)上游元件：OCT(ATTTGCAT)、PSE(GTCACTGTGTTCT AAAAGAACTTG)、TATA(TTAAATA)。

2.3 雙向chU6啟動(dòng)子雙拷貝shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將2chU6-VP1VP2shRNA基因片段和pSilencer 2.1-U6 neo載體片段連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pchU6-shRNA12，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切分析，可見2條長度分別約1300 bp和4200 bp的DNA片段，與pSilencer 2.1-U6 neo和2chU6-VP1VP2shRNA基因片段(1324 bp)的理論值相符合(圖4)。

2.4 pchU6-shRNA12在CEF中的抗病毒活性檢測將 pchU6-shRNA12轉(zhuǎn)染的CEF，接種 IBDV，72 h后，未見CPE，細(xì)胞形態(tài)呈正常的梭狀。而pchU6-CON轉(zhuǎn)染組和IBDV感染CEF兩個(gè)對照組則呈現(xiàn)典型的CPE(圖5)。病毒滴度測定結(jié)果表明，pchU6-shRNA12轉(zhuǎn)染組的病毒滴度小于101TCID50/0.1 mL，而pchU6-CON轉(zhuǎn)染組和IBDV感染組兩個(gè)對照組的病毒滴度均達(dá)到108.75TCID50/0.1 mL(圖6)。

2.5 pchU6-shRNA12在雞胚中的抗病毒活性檢測將pchU6-shRNA12與IBDV混合接種的SPF雞胚，96 h后，雞胚繼續(xù)存活，檢查胚體發(fā)育正常；而同步接種pchU6-CON以及單獨(dú)接種IBDV的兩個(gè)對照組的雞胚則全部死亡，胚體發(fā)育阻滯、出血(圖7)。采用10日齡SPF雞胚測定雞胚組織和尿囊液混合物的ELD50，pchU6-shRNA12組病毒滴度小于101ELD50/0.1 mL，而pchU6-CON組和IBDV感染組兩個(gè)對照組的病毒滴度均達(dá)到107.00ELD50/0.1 mL(圖8)。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對VP1基因和VP2基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測，pchU6-shRNA12轉(zhuǎn)染組VP1基因比IBDV對照組降低了92%，VP2基因比IBDV對照組降低了95%(圖9)。

3 討 論

常用的shRNA表達(dá)載體中RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子(polⅢ)主要為人源或鼠源的U6啟動(dòng)子或人H1啟動(dòng)子，它們在禽源細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性說法不一。Katahira等的研究結(jié)果顯示，小鼠U6啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)shRNA在雞胚中表達(dá)[17]。Dai等也證明，人H1和U6啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)GFP基因特異性shRNA在雞胚中表達(dá)[18]。而Das等則獲得與上述相反的結(jié)果[19]。鑒于此，本研究為了構(gòu)建靶向IBDV的shRNA高效表達(dá)質(zhì)粒，將shRNA表達(dá)載體pSicencer2.1-U6 neo中的人源U6啟動(dòng)子替換成chU6啟動(dòng)子。采用PCR方法從雞的基因組DNA中擴(kuò)增克隆的chU6啟動(dòng)子，與雞的同源性較高，而與人、鼠的同源性較低，該chU6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位含有RNA polⅢ的3個(gè)上游元件，通常認(rèn)為，在RNA polⅢ的上游啟動(dòng)子中，只要靠近起點(diǎn)存在TATA元件，就能起始轉(zhuǎn)錄，PSE和OCT元件的存在可提高轉(zhuǎn)錄效率[20]。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，根據(jù)RNAi效率高的VP1-siRNA2550和VP2-siRNA392兩個(gè)序列，設(shè)計(jì)VP1-shRNA2550與VP2-shRNA392，選用chU6啟動(dòng)子，構(gòu)建一個(gè)同時(shí)靶向IBDV VP1和VP2基因的雙向chU6啟動(dòng)子雙拷貝shRNA表達(dá)質(zhì)粒pchU6-shRNA12，其中 VP1-shRNA2550和 VP2-shRNA392分別由獨(dú)立的chU6驅(qū)動(dòng)表達(dá)。該pchU6-shRNA12有3個(gè)特點(diǎn)：用chU6啟動(dòng)子替代人源U6啟動(dòng)子，以提高外源shRNA在雞細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄效率；VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392雙shRNA可以同時(shí)抑制IBDV的兩個(gè)功能基因VP1和VP2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，雙倍提高RNAi效果；雙啟動(dòng)子獨(dú)立驅(qū)動(dòng)兩個(gè)shRNA高效轉(zhuǎn)錄，不受轉(zhuǎn)錄位置先后的影響。

為驗(yàn)證pchU6-shRNA12在活體外抑制IBDV復(fù)制的功能，用pchU6-shRNA12在CEF進(jìn)行了IBDV復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)，干擾組未出現(xiàn)CPE，細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒滴度小于101TCID50/0.1 mL；而對照組均出現(xiàn)明顯的CPE，病毒滴度均達(dá)到108.75TCID50/0.1 mL。Gao等根據(jù)IBDV VP1基因的2571序列構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體，在Vero細(xì)胞上進(jìn)行了對IBDV復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)，抑制率為87.4%[21]。與之相比，pchU6-shRNA12具有更高的抑制效果，分析原因可能是由于pchU6-shRNA12轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能同時(shí)靶向降解VP1和VP2基因，因此，對IBDV的干擾效率更高。本實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000遞呈表達(dá)質(zhì)粒，其干擾效果與不用轉(zhuǎn)染試劑相當(dāng)(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未提供)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證pchU6-shRNA12在活體內(nèi)抑制IBDV的復(fù)制能力，用雞胚進(jìn)行了雞胚感染抑制試驗(yàn)。pchU6-shRNA12轉(zhuǎn)染組雞胚發(fā)育正常，雞胚組織和尿囊液混合物病毒滴度顯著低于兩個(gè)對照組，表明pchU6-shRNA12在雞胚內(nèi)也能抑制IBDV的復(fù)制；用熒光定量RT-PCR分別檢測VP1和VP2的表達(dá)量，pchU6-shRNA12轉(zhuǎn)染組比單純接種IBDV對照組分別降低了92%和95%，進(jìn)一步表明IBDV復(fù)制的抑制是由于VP1和VP2基因被特異性降解所致。

本研究結(jié)果表明：chU6啟動(dòng)子在pchU6-shRNA12中能高效驅(qū)動(dòng)雙拷貝shRNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的siRNA在體外(CEF)以及體內(nèi)(雞胚)均能抑制IBDV的復(fù)制，為IBDV新型治療預(yù)防生物制品的研發(fā)探索出了一條新的技術(shù)途徑。目前正在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

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