蝎毒多肽抑制白血病干細(xì)胞龕內(nèi)活化的實(shí)驗(yàn)研究*

楊向東，楊文華，史哲新，劉寶山，高 宏，張 蕾，陳艷鑫

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，天津 300193)

蝎毒多肽抑制白血病干細(xì)胞龕內(nèi)活化的實(shí)驗(yàn)研究*

楊向東，楊文華，史哲新，劉寶山，高 宏，張 蕾，陳艷鑫

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，天津 300193)

[目的]觀察蝎毒多肽（PESV）抑制白血病干細(xì)胞（LSC）在骨髓龕內(nèi)的活化效應(yīng)。[方法]分離白血病/急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋML/ALL）患者LSC，置于Transwell小室中，分為高中低劑量組及對照組，分別加入不同濃度蝎毒多肽后培養(yǎng)，計(jì)算不同濃度組及不同時(shí)間段的LSC遷移率。[結(jié)果]PESV組遷移率分別為（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%，與對照組（49.10±6.12）%比較差異具有顯著性（P<0.05），高劑量組遷移率高于中低劑量組。[結(jié)論]不同濃度PESV均有抑制白血病干細(xì)胞活化作用，抑制強(qiáng)度呈濃度依賴。

蝎毒多肽；白血病干細(xì)胞；龕；活化效應(yīng)

隨著白血病治療方法不斷進(jìn)步，治愈白血病面臨最大問題不是如何獲得骨髓形態(tài)學(xué)緩解，而是如何清除患者體內(nèi)白血病干細(xì)胞（LSC）。筆者研究的蝎毒多肽（PESV）是從東亞鉗蝎蝎毒中分離和純化的提取物，是一種細(xì)胞毒成分，具有較強(qiáng)的協(xié)同化療藥物殺傷白血病干細(xì)胞作用。近年研究表明其協(xié)同作用機(jī)制之一是抗白血病干細(xì)胞多藥耐藥。

1 材料

1.1 標(biāo)本及白血病干細(xì)胞株 2010年1—12月，本院收治的初發(fā)及復(fù)發(fā)急性白血?。ˋL）患者35例，男 19 例，女 16 例，平均年齡 39.6（14～80）歲。急性非淋巴細(xì)胞白血?。ˋNLL）23例（其中慢性粒細(xì)胞白血病急粒變 6 例，ANLL－M53例，ANLL－M210 例，ANLL－M44例），急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）12例。初發(fā)21例，復(fù)發(fā)14例（復(fù)發(fā)患者至少半個(gè)月以上未用化療）。無菌操作留取骨髓標(biāo)本各3m L，肝素抗凝，經(jīng)磁珠分離法分離白血病干細(xì)胞，用RPMI－1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至2×106個(gè)/mL備用。

1.2 PESV的制備及鑒定 利用分子篩層析技術(shù)對蝎毒凍干粉分離提取，收集蝎毒Ⅲ-Ⅳ蛋白峰。應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）儀，LC/MS聯(lián)用技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)，蝎毒多肽提取物由50～60個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，根據(jù)SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳（SDS－PAGE）測定結(jié)果，分子量主要在 6 000～7 000之間者符合本實(shí)驗(yàn)要求。收集PESV蛋白峰，臨用時(shí)PESV用生理鹽水溶解稀釋成各濃度。

1.3 主要試劑及儀器 RPIM－1640（Gibco公司），青霉素、鏈霉素（Hyclone公司），環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（蘭州民海生物公司），Transwell板（Corning公司），Matrigel凝膠（BD公司），抗腫瘤壞死因子（TNF－α），（Peprotech公司），胰蛋白酶（Hyclone公司），錐蟲藍(lán)（Amresco公司）。

2 方法

2.1 繪制生長曲線 錐蟲藍(lán)染色，選取活細(xì)胞數(shù)>95%的病例。調(diào)整待用細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)至5×105個(gè)/mL，接種于24孔板，每天用錐蟲藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)，連續(xù)7 d，繪制生長曲線。

2.2 錐蟲藍(lán)實(shí)驗(yàn) 選取對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至5×105個(gè)/mL，180μL接種于96孔板，分為藥物組和對照組分別加入PESV 1、10、100、1000μg/mL和生理鹽水各20μL，每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，孵箱孵育24 h后錐蟲藍(lán)活細(xì)胞拒染法測活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞生長抑制率＝（空白孔平均值－加藥組平均值）/空白孔平均值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.3 LSC在模擬骨髓壁龕中遷移實(shí)驗(yàn) 將8μm孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜上均勻涂一層人工基底膜，5μg/10μL，使之干燥，形成一個(gè)基質(zhì)屏障層。將白血病細(xì)胞PBS洗滌后，懸浮于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，終濃度為2×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加到Transwell小室中，每小室加100μL。24孔板分為實(shí)驗(yàn)組和對照組各加入蝎毒多肽提取物和等量生理鹽水，將小室浸泡于24孔培養(yǎng)板的條件培養(yǎng)基中。37 ℃，5%CO2培養(yǎng) 18 h，取出 Transwell，濾膜用甲醇固定，蘇木精-伊紅染色，水洗，將膜封于載玻片上，于高倍鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，每膜計(jì)數(shù)上、中、下、左、右5個(gè)不同位點(diǎn)的透過細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用線性相關(guān)分析法選擇24 h藥物作用濃度，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LSC分離培養(yǎng) 見圖1。

3.2 LSC生長曲線 白血病干細(xì)胞在體外培養(yǎng)24 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，96 h后進(jìn)入生長平臺期，見圖2。

3.3 PESV（蝎毒多肽）對LSC在模擬骨髓龕中遷移能力的影響 PESV低、中、高濃度均有抑制LSC穿過人工基底膜的能力，其阻抑遷移率分別為（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%。對照組環(huán)磷酰胺（CTX）的阻抑遷移率（49.10±6.12）%。PESV組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量與中、高劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量PESV與低、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組抑制遷移率明顯較高。見表1。倒置顯微鏡下，高劑量組可見侵襲小室下室內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，分布散亂不均，而對照組下室內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較多，多成簇分布。

表1 PESV抑制LSC透過人工基底膜遷移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

表1 PESV抑制LSC透過人工基底膜遷移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

注：與 PESV 組比較，*P<0.05；與中、低劑量組比較，▲P<0.05。

組別 濃度 遷移率實(shí)驗(yàn)組 PESV低劑量 25.01±6.83 PESV中劑量 36.85±3.83 PESV 高劑量 50.73±7.15▲對照組 CTX 49.10±6.12*

4 討論

目前治愈白血病的關(guān)鍵之一是清除患者體內(nèi)LSC，抑制白血病的復(fù)發(fā)，不僅僅是如何獲得骨髓形態(tài)學(xué)緩解、免疫學(xué)緩解、遺傳學(xué)緩解。LSC靜止于骨髓壁龕內(nèi)，通常處于G0期，并不進(jìn)入細(xì)胞周期，當(dāng)骨髓壁龕微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，LSC才會(huì)進(jìn)入細(xì)胞周期，開始增殖分化。所以常規(guī)化療藥物對LSC無能為力；分子靶向藥物雖然可以識別它，但不能傷害或清除LSC；同樣干細(xì)胞移植也不能清除患者體內(nèi)的LSC。因此，調(diào)控LSC長期保持G0期狀態(tài)就尤為關(guān)鍵，只有這樣才能使控制白血病復(fù)發(fā)或進(jìn)展成為可能。

干細(xì)胞壁龕的假說是在20世紀(jì)70年代針對造血干細(xì)胞（HSCs）的特殊微環(huán)境而提出來的[1]?，F(xiàn)已在多種生物的不同組織中明確了相應(yīng)干細(xì)胞的壁龕細(xì)胞，如果蠅卵巢中的帽子細(xì)胞、末端絲狀細(xì)胞和內(nèi)發(fā)生鞘細(xì)胞，哺乳動(dòng)物骨髓中的成骨細(xì)胞等[2]。干細(xì)胞是一類未分化的細(xì)胞或原始細(xì)胞，具有自我更新和高度增殖能力，并可以分化成機(jī)體內(nèi)至少一種成熟細(xì)胞。干細(xì)胞有多種重要的特征，如自我更新和分化潛能、對稱及非對稱性的分裂方式、處于有絲分裂G0期、具有分化為所寄居組織細(xì)胞和跨譜系分化的能力等。干細(xì)胞的生物學(xué)特性一方面是自身預(yù)先程序化的結(jié)果；另一方面受其所處微環(huán)境的影響[3]。干細(xì)胞特征的維持與干細(xì)胞所處的壁龕微環(huán)境有密切關(guān)系。干細(xì)胞壁龕可通過與干細(xì)胞之間的直接和（或）間接作用，發(fā)揮多重生物學(xué)功效—錨定干細(xì)胞并調(diào)控其處于G0期。正常情況下，干細(xì)胞寄居在組織或器官特定的壁龕中，這與干細(xì)胞和壁龕成分之間表達(dá)的黏附分子有關(guān)。鈣黏蛋白和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附是普遍存在的壁龕錨定干細(xì)胞的機(jī)制[4]。在果蠅卵巢中，生殖干細(xì)胞（GSCs）與帽子細(xì)胞、體干細(xì)胞與內(nèi)生發(fā)鞘細(xì)胞之間都存在DE-cadherin，該基因突變可以引起干細(xì)胞的丟失；在骨髓造血微環(huán)境中，HSCs能定居于以成骨細(xì)胞為主的壁龕中就與N-cadherin有關(guān)[5]。干細(xì)胞表面的整合素可以介導(dǎo)干細(xì)胞與ECM之間的黏附，從而使干細(xì)胞定居于壁龕中。表皮干細(xì)胞一個(gè)顯著的特點(diǎn)是與基底膜的黏附，這種黏附也是通過整合素實(shí)現(xiàn)的。b1-integrin可以作為特異性較高的表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物。干細(xì)胞壁龕可以錨定干細(xì)胞的另一個(gè)證據(jù)是它可以招募新的干細(xì)胞，即干細(xì)胞的“歸巢”。對經(jīng)照射宿主的骨髓移植HSCs后觀察，發(fā)現(xiàn)移植的HSCs在細(xì)胞因子的趨化作用下最終進(jìn)入宿主骨髓的HSCs壁龕中[6]。同時(shí)，干細(xì)胞壁龕還為干細(xì)胞提供了一個(gè)控制增殖、抑制分化的微環(huán)境。

現(xiàn)在臨床應(yīng)用的全蝎多屬東亞鉗科，全蝎主要有效成分是蝎毒多肽提取物PESV，它由多種含有20～80個(gè)氨基酸、分子量3 000～10 000蛋白組成，大多數(shù)有3～4對二硫鍵交聯(lián)而成。PESV作為多種蝎毒抗癌組分中一種，受到越來越多學(xué)者的重視。有學(xué)者證實(shí)PESV至少通過抑制Bcl-2及促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的[7]；同時(shí)還在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PESV對數(shù)種腫瘤細(xì)胞具有毒性作用，可使進(jìn)入S期的癌細(xì)胞明顯減少，G1、S和G2期細(xì)胞的百分比增多，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[8]。

雖然本研究從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PESV對白血病細(xì)胞黏附力及侵襲力的有抑制作用，并呈劑量依賴性，但白血病髓外浸潤的發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)、多步驟相互影響，相互作用的結(jié)果[9]。本課題組將進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度探討PESV阻抑白血病髓外浸潤的分子機(jī)制。

[1]Lapidot T,Sirard C,Vormoor J,etal.A cell initiating human acute myeloid leukemiaaftertransplantation intoSCIDmice[J].Nature,1994,367(6464):645-648.

[2]Bonnet D,Dick JE.Human acutemyeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].NatMed,1997,3(7):730-737.

[3]Passegue E,Jamieson Ch,Ailles LE,et al.Normal and leukemichematopoiesis:are leukemiasa stem cell disorder or a reacquisitionofstem cellcharacteristics?[J].ProcNatlAcad SciUSA,2003,100(11):11842-11849.

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[5]Hope KJ,J in L,Dick JE.Acutemyeloid leukemia originates from ahierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity[J].Nat Immunol,2004,5(7):738-743.

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[8]孔天翰，林 山，韓雪飛.蝎毒多肽對腫瘤細(xì)胞的抑制作用研究[J].中國病理生理雜志，2004，20（6）：968－972.

[9]楊文華，楊向東，史哲新，等.蝎毒多肽干預(yù)白血病細(xì)胞浸潤效應(yīng)及分子機(jī)制[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（1）：15.

Experiment research on PESV for inhibiting activation of leucem ia stem cell in the niche

YANGXiang-dong,YANGWen-hua,SHIZhe-xin,etal
(DepartmentofHematology,The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China)

[Objective]To observe the effectof PESV(peptide extract from scorpion venom)for inhibiting the activation of leucemia stem cells(LSC)in the niche.[Methods]LSCwere isolated from patientswith AML/ALL and stored in the Transwell.Then theywere divided into four groups:high-dose group,middle-dose group,low-dose group and the positive control group.After cultured with different concentrations of PESV,the transport ratios of LSC in various concentration groups were computed at different time.[Results]The transportratiosculturedwith differentconcentrationsofPESVwere(25.01±6.83)%,(36.85±3.83)%,(50.73±7.15)%,and therewasasignificant difference compared with thatof the positive controlgroup(49.10±6.12)%(P<0.05).The transport ratio in the high-dose group ismore than that of the middle and lose-dose groups.[Conclusion]All different concentrations of PESV have the inhibiting effects against the activation of LSCwith a inhibiting intensity depending on the concentrationsof PESV.

PESV;LSC;niche;activating effect

R285.5

A

1672-1519(2011)04-0329-03

天津市教委計(jì)劃資助項(xiàng)目（OTJCYBJC1150）。

楊向東（1977-），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事血液病臨床與實(shí)驗(yàn)研究工作。

2011-04-10）